Test tal-PCR f'ħin reali tal-fluworexxenza ta 'Listeria monocytogenes

PCR fluworexxenti f'ħin reali sejbien in vitro ta 'Listeria monocytogenes.

Speċifikazzjoni: 96 T / kaxxa
Il-kit huwa maħżun fi 2 - 8 ℃.
Il-perjodu ta 'validità huwa ta' 12-il xahar.

Speċifikazzjoni: 96 T / kaxxa

Użi: PCR fluworexxenti f'ħin reali sejbien in vitro ta 'Listeria monocytogenes.

Prinċipju ta 'sejbien: Il-kitt fih primers speċifiċi għal Listeria monocytogenes. Meta l-kampjun ikun fih Listeria monocytogenes, id-DNA tal-Listeria monocytogenes estratta wara l-arrikkiment minn qabel tiġi amplifikata b'mod esponenzjali bil-PCR. Matul ir-reazzjoni, is-sonda fluworexxenti speċifika għal Listeria monocytogenes ibridizza ma 'l-aċidu nuklejku fil-mira u hija simultanjament Taq enzyme Hydrolysis biex tissepara l-grupp fluworexxenti mill-grupp ta' tifi fuq is-sonda: sabiex il-preżenza ta 'Listeria monocytogenes tkun tista' tiġi ġġudikata f'ħin reali minn iż-żieda florexxenti.

Prodott u kompożizzjoni:

Kompożizzjoni (96T / kit)	Speċifikazzjoni	kwantità
Soluzzjoni ta 'estrazzjoni tad-DNA	3ml	Tubu 1
Soluzzjoni ta 'reazzjoni ta' Listeria monocytogenes PCR	1100ul	Tubu 1
Tektek enżima (5U / ul)	20ul	Tubu 1
Listeria monocytogenes kontroll pożittiv	40ul	Tubu 1
Listeria monocytogenes Kontroll Negattiv	0.5ml	Tubu 1
Istruzzjoni manwali		1

Kundizzjonijiet tal-ħażna u data ta 'skadenza tal-kit:
1. Il-kit huwa maħżun fi 2 - 8 ℃.
2. Il-perjodu ta 'validità huwa ta' 12-il xahar.

Strumenti applikabbli:
Serje ABI7500, 9600, MJ opticon2, Bio-Rad u strumenti oħra fluworexxenti kwantitattivi tal-PCR huma disponibbli

Metodu sperimentali:
1. Ħu 1ml tas-soluzzjoni ta 'arrikkiment f'tubu ta' ċentrifuga sterili ta '1.5m1, iċċentrifuga f'10.000rpm għal 5min, u armi s-supernatant; uża l-metodu klassiku ta 'estrazzjoni tal-kloroform tal-fenol biex tittestja l-mudell estratt jew aħżnu f'20C sakemm jiġi ttestjat.
2. Poġġi s-soluzzjoni tar-reazzjoni tal-PCR f'temperatura tal-kamra biex tibbilanċja, ħu l-enżima Taq wara li tidwib, u żid l-enżima Taq f'2∪ / tubu, jiġifieri, kull sistema ta 'reazzjoni tat-test hija ppreparata bħala: Soluzzjoni ta' reazzjoni tal-PCR 22.5u1 + 0.4ulTaq enżima.
3. Żid il-mudell: Ħoll l-estratt ta 'aċidu nuklejku maħżun f'temperatura ta' -20 ° C f'temperatura tal-kamra u ċċentrifuga f'13,000 rpm għal 5 minuti. Il-kontrolli negattivi u pożittivi huma mdewba f'temperatura tal-kamra qabel l-użu. F'kull tubu ta 'reazzjoni PCR, żid 2 ul tal-mudell jew kontrolli negattivi u pożittivi pproċessati fil-pass 1, għatti t-tubu, poġġi fuq l-istrument PCR, u rreġistra n-numru tal-kampjun korrispondenti.
4. Żona ta 'amplifikazzjoni u sejbien abbord: il-kundizzjonijiet tar-reazzjoni huma 95C: 3min, 1 ċiklu; 95C: 5sec, 60C: 40sec (akkwist tas-sinjal), 40 ċiklu. Is-sistema ta 'reazzjoni kienet issettjata għal 25u1.
Għall-istrument PCR ta 'fluworexxenza b'ħafna kanali, is-sinjal huwa ssettjat għal Fam fluorescein.

Ġudizzju tar-riżultati:
Jekk jogħġbok irreferi għall-manwal għad-dettalji.

Prekawzjonijiet għall-użu tal-kit:
1. Dan il-kit jintuża biss għal skopijiet ta 'ttestjar u riċerka in vitro, jekk jogħġbok aqra t-test sħiħ ta' dan il-manwal b'attenzjoni qabel ma tibda tużah.
2. L-esperiment għandu jkun maqsum strettament: żona ta 'preparazzjoni ta' qabel il-PCR-ipprepara reaġenti sperimentali; erja tal-ipproċessar tal-kampjun - kampjuni li għandhom jiġu ttestjati, ipproċessar tal-mudell; żona ta 'skoperta-PCR amplifikazzjoni, skoperta.
3. Għall-istandards rilevanti tal-immaniġġjar tal-laboratorju, jekk jogħġbok irreferi għall-implimentazzjoni tal-istandards tal-immaniġġjar għal-laboratorji tal-amplifikazzjoni tal-ġene maħruġa mill-awtoritajiet nazzjonali rilevanti.

Jekk trid tkun taf aktar, jekk jogħġbok ikkuntattjana

Mistoqsijiet Trivia: Listeria monocytogenes

Dwar listeria

Definizzjoni tal-Listeria

Listeria huwa batterju anerobiku fakultattiv li huwa l-aġent kawżattiv tal-listerjożi. Listeria huwa batterju Gram-pożittiv li jappartjeni għall-phylum b'ħitan ħoxnin, imsemmi wara Joseph Lister. L-aktar juża l-ikel bħala vettur u huwa wieħed mill-aktar patoġeni li jinqatlu mill-ikel.

Listeria hija kullimkien fl-ambjent u tista 'tinstab f'ħafna ikel. Laħam, bajd, tjur, frott tal-baħar, prodotti tal-ħalib, ħxejjex, eċċ kollha ġew ippruvati li huma sorsi ta 'infezzjoni ta' Listeria. L-avvelenament ta ’Listeria monocytogenes jista’ jikkawża infezzjonijiet tad-demm u tat-tessut tal-moħħ. Bosta pajjiżi ħadu miżuri biex jikkontrollaw Listeria monocytogenes fl-ikel u stabbilixxew standards korrispondenti.

Sorsi tal-Listeria

Listeria ġiet skoperta għall-ewwel darba fl-1926 minn xjenzat Ingliż ta 'oriġini Afrikana t'Isfel Murray fuq fenek marid. Fil-kommemorazzjoni tal-missier tal-kirurġija moderna tad-diżinfezzjoni, il-fiżjoloġista Ingliż Joseph Lister (1827-1912), fl-1940, ġie msemmi Listeria monocytogenes fit-3 Kungress Internazzjonali tal-Mikrobijoloġija.

Listeria speċi

Il-Listeria monocytogenes rikonoxxuta internazzjonalment għandha s-seba 'razez li ġejjin:
Listeria monocytogenes, Listeria mutans, Listeria innocolus, Listeria welsii, Listeria sileeri, Listeria monocytogenes, Listeria monocytogenes. Fost dawn, L. monocytogenes huwa l-uniku wieħed li jista 'jikkawża mard uman. Huwa patoġenu ta 'mard żoonotiku. Avvelenament sever jista 'jikkawża infezzjonijiet tad-demm u tat-tessut tal-moħħ. Listeria monocytogenes hija mqassra bħala Listeria monocytogenes, li hija batterja Gram-pożittiva u tappartjeni għall-phylum b'ħitan ħoxnin.

Infezzjoni tal-Listeria

Fil-ġeneru Listeria, Listeria monocytogenes biss tista 'tikkawża mard bħal meninġite, sepsis, korriment, u infezzjoni tat-twelid fil-bnedmin. Jekk persuna ta 'immunodefiċjenza tiżviluppa infezzjoni b'Listeria, il-marda hija serja u r-rata ta' mortalità Sa 33%.

Sintomi tal-listerja

Infezzjoni tal-Listeria tista 'tkun akkumpanjata minn deni, uġigħ fl-għonq, rimettar jew dijarea. Forom aktar kumplessi jistgħu wkoll jikkawżaw enċefalite u forom speċifiċi ta 'meninġite. Nisa tqal huma wkoll f'riskju li jikkuntrattaw Listeria. Nisa tqal għandhom 20 darba aktar ċans li jiġu infettati bil-Listeria minn oħrajn. Anki jekk m'hemm l-ebda korriment jew twelid mejjet, it-tarbija tat-twelid jista 'jkollha din il-marda infettiva mit-twelid, għalhekk hemm rata ta' mortalità għolja ħafna.

Listeria monocytogenes

X'inhuma listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes huwa patoġenu ta 'mard żoonotiku. Jista 'jikkawża listerjożi fil-bnedmin u fl-annimali. Wara l-infezzjoni, huwa manifestat prinċipalment bħala sepsis, meninġite u ċelloli mononukleari. Minħabba li l-batterju huwa parassita intraċellulari, it-tneħħija tiegħu mill-ospitant tiddependi prinċipalment fuq il-funzjoni immuni ċellulari. Għalhekk, listeriosis hija prinċipalment fit-trabi tat-twelid, l-anzjani, u nies immunokompromessi. Listeria monocytogenes hija prinċipalment infettata mill-ħmieġ, u tista 'wkoll tidħol fil-ġisem mill-għajnejn u l-ġilda bil-ħsara u l-membrani mukużi biex tikkawża infezzjoni.

Distribuzzjoni ta 'Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes teżisti b'mod wiesa 'fin-natura, mhix faċli biex tiġi ffriżata u mdewba, u tista' tittollera pressjoni osmotika ogħla. Il-batterja hija preżenti fil-ħamrija, fl-ilma tal-wiċċ, fid-drenaġġ, fl-ilma mormi, fil-pjanti, fil-ħaxix maħżun, fil-ħaxix immuffat, u għalhekk l-annimali jistgħu jinbelgħu faċilment il-batterja.

Ir-rotta ta 'trasmissjoni ta' Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes prinċipalment juża l-ikel bħala aġent infettiv. Huwa wieħed mill-aktar patoġeni fatali li jinġarru mill-ikel, u jikkawża li 20 sa 30% tan-nies infettati jmutu. Ir-rata ta 'mortalità hija saħansitra ogħla minn dik ta' Salmonella u Botox. In-nies jieklu prinċipalment ġobon artab, tiġieġ imsaħħan iżżejjed, hot dogs mhux imsaħħna, ħalib frisk, ħalib pasturizzat, ġelat, steak nej, chops tal-ħaruf, insalata tal-kaboċċa, karfus, tadam, torti Franċiżi, ilsien tal-majjal iffriżat U l-bqija. Madwar 80% -90% tal-każijiet huma kkawżati minn ikel ikkontaminat.
Il-batterja tista 'tidħol fil-ġisem mill-għajnejn u l-ġilda bil-ħsara u l-membrani mukużi biex tikkawża infezzjoni. Wara l-infezzjoni, nisa tqal jinfettaw il-fetu jew it-twelid permezz tal-plaċenta jew il-kanal tat-twelid. Il-batterji li jgħixu fil-vaġina u ċ-ċerviċi jistgħu wkoll jikkawżaw infezzjonijiet. Il-kuntatt sesswali huwa wkoll rotta possibbli ta 'trasmissjoni tal-marda, u hemm xejra' l fuq.

Marda ta 'Listeria monocytogenes

Sintomi ta 'Listeria monocytogenes

Jekk Listeria monocytogenes timradx wara li tidħol fil-ġisem tal-bniedem huwa relatat mal-virulenza tal-batterja u l-età u l-istat immuni tal-ospitant, minħabba li l-batterju huwa batterju parassita intraċellulari, u t-tneħħija tiegħu mill-ospitant tiddependi prinċipalment fuq il-funzjoni immuni ċellulari . Għalhekk, persuni suxxettibbli huma trabi tat-twelid, nisa tqal u adulti 'l fuq minn 40 sena. Barra minn hekk, alkoħoliċi, persuni b'sistemi immuni bil-ħsara jew difettużi, pazjenti li jirċievu aġenti immunosoppressivi u kortikosterojdi, u trapjanti ta 'organi huma wkoll suxxettibbli għal infezzjoni mill-batterja. Il-manifestazzjonijiet kliniċi tal-marda, individwi adulti b’saħħithom għandhom sintomi ħfief li jixbħu l-influwenza, twelid, nisa tqal, pazjenti b’immunodefiċjenza bi qtugħ ta ’nifs, rimettar, raxx emorraġiku, konġuntivite suppurattiva, deni, konvulżjonijiet, koma, abort spontanju, meninġite, Sepsi sakemm mewt.

Trattament ta 'Listeria monocytogenes

Penicillin, ampicillin, gentamicin, erythromycin, eċċ jistgħu jintużaw għat-trattament ta 'infezzjoni ta' Listeria monocytogenes. L-eritromiċina u antibijotiċi oħra bi spettru wiesa 'huma allerġiċi għall-peniċillina.

Prevenzjoni ta 'Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes jista 'jgħix fl-ipproċessar termali normali, it-trattament bis-sħana qatel il-komunità batterika kompetittiva, u b'hekk jagħmel Listeria monocytogenes faċli biex jgħix fin-nuqqas ta' kundizzjonijiet ambjentali kompetittivi, għalhekk fl-ipproċessar ta 'l-ikel, it-temperatura tal-qalba trid tilħaq 70 ° C għal aktar minn 2 minuti. Listeria monocytogenes hija mifruxa fin-natura tagħha, allura anke jekk il-prodott ġie msaħħan iżżejjed u pproċessat, il-Listeria monocytogenes hija kompletament inattivata, iżda tista 'tikkawża tniġġis sekondarju tal-prodott, allura wara li ssajjar, tevita Tniġġis sekondarju huwa estremament importanti. Minħabba li Listeria monocytogenes xorta tista 'tikber u tirriproduċi f'4 ° C, ikel tal-friġġ mhux imsaħħan iżid ir-riskju ta' avvelenament mill-ikel, u ikel tal-friġġ jeħtieġ li jissaħħan qabel il-konsum.

Test tal-Listeria monocytogenes

1. Metodu ta 'kultura batterika

Il-metodu tat-test tradizzjonali għal Listeria fl-ikel huwa li jwettaq arrikkiment minn qabel jew arrikkiment selettiv, u juża l-kolonji suspettużi iżolati u kkultivati għal esperimenti ta 'reazzjoni bijokimika, esperimenti ta' emoliżi, u esperimenti ta 'emoliżi kooperattiva (CAM P). Wara li Listeria monocytogenes ġiet serotipata aktar. L-arrikkiment u l-arrikkiment selettiv huma passi indispensabbli f'dan il-metodu. Il-metodi ta 'arrikkiment jinkludu prinċipalment: metodu ta' arrikkiment bil-kesħa u metodu ta 'kultivazzjoni ta' temperatura normali. Il-metodu ta 'arrikkiment kiesaħ huwa kkultivat f'temperatura ta' 4 ° C għal 30 jum, xi kultant sa sena. F'temperatura tal-kamra, il-batterji għandhom jiġu kkultivati għal 24h sa 7d. Għalhekk, il-metodu ta 'skoperta tradizzjonali jeħtieġ 7-11 ijiem biex jiżola u jidentifika Listeria monocytogenes, għalhekk il-perjodu ta' skoperta tal-metodu tradizzjonali huwa itwal.

2. Agglutinazzjoni tas-serum

Skond antiġeni batteriċi u antiġeni flagellari, LM huwa maqsum f'16-il serotip: 1 / 2a, 1 / 2b, 1 / 2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 5, 6a, 6b , 7. L-istruttura tal-antiġen m'għandha x'taqsam xejn mal-virulenza. Il-fatturi patoġeniċi ewlenin għall-bnedmin huma s-serotipi 1 / 2a, 1 / 2b, u 4b, li jammontaw għal madwar 90% tal-każijiet globali ta 'din il-marda.

3. Metodi ta 'ttestjar tal-bijoloġija molekulari

3 .1 Teknoloġija ta 'skoperta ta' sonda
Din it-teknoloġija hija l-ewwel organiżmu molekulari użat fl-iskoperta tal-Listeria
Tgħallem it-teknoloġija. Sa mill-1988, Atin et al. ikklona u sekwenza framment tad-DNA ta '500bp tal-ġene Listeria beta-hemolysin, u sintetizza erba' sondi oligonukleotidi minn din is-sekwenza, ittikkettja s-sonda bi 32P, u wettaq esperiment ta 'ibridizzazzjoni ta' punti Ġie kkonfermat li s-sonda rreaġixxiet biss ma 'Listeria monocytogenes, u kien negattiv ma 'speċi oħra ta' Listeria u batterji mhux tal-ġeneru, u wera speċifiċità tajba.

3.2 Teknoloġija ta 'skoperta ta' reazzjoni katina tal-polimerase (PCR)
L-iżvilupp tal-PCR huwa pjuttost matur, u huwa użat ħafna fl-iskoperta tal-Listeria. Primers speċifiċi għall-amplifikazzjoni tal-PCR huma mfassla abbażi tas-sekwenza speċifika tal-ġene tal-virulenza ta 'Listeria monocytogenes, u waħda hija mfassla abbażi tas-sekwenza speċifika fil-ġenoma ta' Listeria monocytogenes. Is-sekwenzi fil-mira użati b'mod komuni huma ġeni ta 'virulenza bħal hly A, iap, inl, Dth-18. Il-vantaġġ li tuża l-metodu PCR biex tiskopri Listeria huwa l-ispeċifiċità tal-metodu, iżda l-iżvantaġġ huwa s-sensittività baxxa; il-kultura tal-kampjun hija amplifikata wara estrazzjoni kimika, li ttejjeb ir-rata ta 'skoperta tal-kampjun; u jista 'Listeria monocytogenes "ħaj, mhux kultivabbli" ma setax jinstab b'metodi ta' arrikkiment tradizzjonali.