Prinċipju tal-PCR f'ħin reali
Struttura Aetamiprid
Il-PCR kwantitattiva tal-fluworexxenza f'ħin reali hija metodu għall-kejl tal-ammont totali ta 'prodotti wara kull ċiklu ta' reazzjoni katina tal-polimerasa (PCR) bl-użu ta 'kimiċi fluworexxenti f'reazzjoni ta' amplifikazzjoni tad-DNA. Metodu għal analiżi kwantitattiva ta 'sekwenzi speċifiċi ta' DNA f'kampjun li għandu jiġi ttestjat b'metodi ta 'referenza interni jew esterni.
PCR f'ħin reali huwa l-iskoperta f'ħin reali tal-proċess PCR permezz tas-sinjal fluworexxenti matul il-proċess ta 'amplifikazzjoni tal-PCR. Minħabba r-relazzjoni lineari bejn il-valur Ct tal-mudell u n-numru tal-kopja inizjali tal-mudell matul il-perjodu esponenzjali tal-amplifikazzjoni tal-PCR, din issir il-bażi għall-kwantifikazzjoni.
Il-prinċipju bażiku tat-teknoloġija tal-PCR huwa simili għall-proċess ta 'replikazzjoni naturali tad-DNA, u l-ispeċifiċità tiegħu tiddependi fuq oligonucleotide primers komplementari għaż-żewġt itruf tas-sekwenza fil-mira.
Reaġenti tal-PCR
Kitt tal-PCR inkluż mudell ta 'aċidu nuklejku purifikat, deoxyribonucleotide (dNTP), primers oligonucleotide u DNA polymerase. Il-purifikazzjoni tal-aċidu nuklejku u l-valutazzjoni tal-kwalità huma passi importanti fil-proċess tal-esperiment tal-PCR. Huwa importanti li jintużaw tekniki xierqa biex jiżolaw u jippurifikaw aċidi nuklejċi minn materja prima, billi dan il-pass jaffettwa r-reazzjoni ta 'amplifikazzjoni.
DNA polymerase tikkatalizza ż-żieda ta 'dNTPs ma' kurduni ta 'DNA estiżi billi żżid bażijiet li huma kumplimentari għall-korda tal-mudell. L-identifikazzjoni ta 'polimerażi tad-DNA termostabbli u modifiki sussegwenti għal dawn l-enzimi għandhom rwol ewlieni fl-iżvilupp u l-adozzjoni mifruxa tar-reazzjoni tal-PCR.
Reazzjoni tal-PCR
Ħames elementi tar-reazzjoni tal-PCR: Hemm ħames tipi ta ’sustanzi li jipparteċipaw fir-reazzjoni tal-PCR: primers (PCR primers huma frammenti tad-DNA, u l-primers għar-replikazzjoni tad-DNA fiċ-ċellola huma fergħa ta’ RNA), enżimi, dNTPs, mudelli u buffers ( li minnhom hija meħtieġa Mg2 +).
Passi tal-PCR
Il-proċess standard tal-PCR huwa maqsum fi tliet passi:
Denaturazzjoni tad-DNA: (90 ℃ -96 ℃): Mudell ta 'DNA bi stranded taħt l-azzjoni tas-sħana, il-bond ta' l-idroġenu jinqasam biex jifforma DNA ta 'strand wieħed.
Ittemprar: (60 ℃ -65 ℃): It-temperatura tas-sistema hija mnaqqsa, u l-primers huma kkombinati mal-mudell tad-DNA biex jiffurmaw linja doppja lokali.
Estensjoni: (70 ℃ -75 ℃): Taħt l-azzjoni ta 'l-enżima Taq (madwar 72 ℃, l-aħjar attività), dNTP jintuża bħala l-materja prima, li jibda mit-3' tarf tal-primer u jestendi mill-5 ′ → 3 ′ tarf. Sintetizza l-istrixxi tad-DNA komplementari għall-mudell.
Kull ċiklu jgħaddi minn denaturazzjoni, ittemprar u estensjoni, u l-kontenut tad-DNA jirdoppja. Issa xi PCRs għandhom reġjun ta 'amplifikazzjoni qasir, u anke jekk l-attività ta' l-enżima Taq mhix l-aħjar, jistgħu jiġu replikati f'perjodu qasir ta 'żmien, u għalhekk tista' tinbidel għal metodu f'żewġ stadji, jiġifieri ittemprar u estensjoni huma imwettaq f'60 ℃ -65 ℃ fl-istess ħin. Sabiex tnaqqas il-proċess tat-temperatura u l-waqgħa fit-temperatura, il-veloċità tar-reazzjoni tiżdied.
Riżultati tal-PCR u analiżi tal-PCR
1. Jekk hemm kurva standard bai, ikkalkula skond il-kurva standard. du
2. Ġeneralment, il-kwantità relattiva hija kkalkulata bil-metodu delta delta CT.
3. Eżempji huma kif ġej: il-valur CT tal-ġene A fil-grupp dao tal-kontroll huwa 20, u l-valur CT tal-kontroll intern (bħal βactin) huwa 15. Il-valur CT tal-ġene A fil-grupp sperimentali kien 18, u il-valur CT tar-referenza interna kien 14.
4. Ikkalkula l-volum tal-kampjun l-ewwel: delta CT = 15-14 = 1. Il-qawwa ta '2 hija 2. Fi kliem ieħor, il-volum tal-kampjun tal-grupp sperimentali huwa d-doppju ta' dak tal-grupp ta 'kontroll. Ġen A: delta CT = 20-18 = 2. Il-qawwa ta '2 hija 4. Fi kliem ieħor, l-ammont ta' ġene A fil-grupp sperimentali kien 4 darbiet dak tal-grupp ta 'kontroll. Madankollu, minħabba li l-ammont ta 'kampjun miżjud huwa darbtejn, allura 4 = 2 = 2, l-ammont relattiv finali huwa 2 darbiet.
5. Ftit punti: L-ispeċifiċità tal-amplifikazzjoni għandha tiġi ddeterminata. Il-valur CT tal-istess mira biss jista 'jitnaqqas (l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tista' tkun differenti). Il-qawwa ta '2 hija biss il-valur teoretiku, u l-effiċjenza attwali ta' amplifikazzjoni hija inqas minn 2. Syber Green.
Applikazzjonijiet PCR
Il-PCR ġeneralment jiġi applikat għall-aspetti li ġejjin:
1. Riċerka bażika dwar l-aċidu nuklejku: klonazzjoni tal-ġenoma
2. PCR asimmetriku biex jipprepara du DNA bi stranding wieħed għas-sekwenzar tad-DNA
3. Reverse PCR biex tiddetermina reġjuni tad-DNA mhux magħrufa
4. It-traskrizzjoni inversa daoPCR (RT-PCR) tintuża biex tiskopri l-livell ta 'espressjoni tal-ġene fiċ-ċelloli, l-ammont ta' virus RNA u direttament ikklona s-cDNA ta 'ġeni speċifiċi
5. Il-PCR kwantitattiva tal-fluworexxenza tintuża għall-monitoraġġ f'ħin reali tal-prodotti tal-PCR
6. Amplifikazzjoni rapida ta 'truf ta' cDNA
7. Sejbien ta 'espressjoni tal-ġene
8. Applikazzjonijiet mediċi: sejbien ta 'mard batteriku u virali; dijanjosi ta 'mard ġenetiku; dijanjosi tat-tumuri; tapplika għall-forensika.
Magna PCR
Il-magna PCR tissejjaħ ukoll amplifikatur tal-ġene PCR, amplifikatur tal-aċidu nuklejku tal-PCR, amplifikatur tal-aċidu nuklejku tar-reazzjoni katina tal-polimerasi, huwa tip ta ’strument u tagħmir li juża teknoloġija PCR (reazzjoni katina Polimerase, reazzjoni katina tal-polimerase) biex jamplifika DNA speċifiku Huwa użat ħafna f'laboratorji mediċi u bijoloġiċi, per eżempju, biex jiġi ddeterminat jekk il-kampjun hux se juri mappa tal-mard ġenetiku, dijanjosi ta 'mard infettiv, replikazzjoni tal-ġene, u ttestjar tal-paternità.
PCR inc
Kumpaniji Maġġuri Profilati fis-Suq Globali ta ’Dijanjostika PCR huma: Abbott Laboratories,
Teknoloġiji Agilent Inc.,
Alere Inc., Asuragen Inc.,
Biocartis Group Nv, Biofire Diagnostics LLC. (Akkwistat Minn Biomerieux),
Biomerieux Sa,
Bio-Rad Laboratories Inc.,
Cepheid (Kumpanija Danaher),
Genmark Diagnostics Inc.,
Hologic Inc., Korporazzjoni Luminex,
Meridian Bioscience Inc.,
Qiagen NV,
Grupp Quantumdx,
Blat,
Bioscience Spartan,
T2 Bijosistemi