Test PCR en temps réel de fluorescence de Listeria monocytogenes

salmonelle

Détection in vitro par PCR fluorescente en temps réel de Listeria monocytogenes.

Spécification: 96 T/boîte
Le kit est stocké à 2 - 8℃.
La durée de validité est de 12 mois.
Spécification: 96 T/boîte

Utilisations: Détection in vitro par PCR fluorescente en temps réel de Listeria monocytogenes.

Principe de détection: Le kit contient des amorces spécifiques à Listeria monocytogenes. Lorsque l'échantillon contient Listeria monocytogenes, l'ADN de Listeria monocytogenes extrait après pré-enrichissement est amplifié de manière exponentielle par PCR. Au cours de la réaction, la sonde fluorescente spécifique de Listeria monocytogenes s'hybride avec l'acide nucléique cible et est simultanément l'enzyme Taq Hydrolyse pour séparer le groupe fluorescent du groupe d'extinction sur la sonde : afin que la présence de Listeria monocytogenes puisse être jugée en temps réel par l'incrément de fluorescence.

Produit et composition :
Composition (96T/kit)SpécificationsQuantité
Solution d'extraction d'ADN3 mlTube 1
Solution de réaction PCR Listeria monocytogenes1100ulTube 1
Enzyme du robinet (5U/ul)20ulTube 1
Contrôle positif Listeria monocytogenes40ulTube 1
Listeria monocytogenes Contrôle Négatif0.5 mlTube 1
Manuel d'instruction1
Conditions de conservation et date de péremption du kit :
1. Le kit est stocké à 2 - 8℃.
2. La période de validité est de 12 mois.

Instruments applicables :
ABI7500, séries 9600, MJ opticon2, Bio-Rad et d'autres instruments de PCR quantitatifs fluorescents sont disponibles

Méthode expérimentale:
1. Prélever 1 ml de solution d'enrichissement dans un tube à centrifuger stérile de 1.5 ml, centrifuger à 1 10.000 tr/min pendant 5 minutes et jeter le surnageant ; utilisez la méthode d'extraction classique au phénol et au chloroforme pour tester le modèle extrait ou stockez-le à 20C jusqu'à ce qu'il soit testé.
2. Placer la solution de réaction PCR à température ambiante pour s'équilibrer, prendre l'enzyme Taq après fusion et ajouter l'enzyme Taq à 2 ∪/tube, c'est-à-dire que chaque système de réaction de test est préparé comme suit : Solution de réaction PCR 22.5u1+0.4ulTaq enzyme.
3. Ajouter la matrice : Décongeler l'extrait d'acide nucléique stocké à -20°C à température ambiante et centrifuger à 13,000 5 tr/min pendant 2 minutes. Les contrôles négatifs et positifs sont décongelés à température ambiante avant utilisation. Dans chaque tube de réaction PCR, ajoutez 1 ul du modèle ou des contrôles négatifs et positifs traités à l'étape XNUMX, couvrez le tube, placez-le sur l'instrument PCR et enregistrez le numéro d'échantillon correspondant.
4. Zone d'amplification et de détection embarquée : les conditions de réaction sont 95C : 3min, 1 cycle ; 95C : 5sec, 60C : 40sec (acquisition du signal), 40 cycles. Le système réactionnel a été réglé à 25ul.
Pour l'instrument PCR à fluorescence multicanaux, le signal est réglé sur Fam fluorescéine.

Jugement des résultats :
Veuillez vous référer au manuel pour plus de détails.

Précautions d'utilisation du kit :
1. Ce kit est uniquement utilisé à des fins de test et de recherche in vitro, veuillez lire attentivement le texte intégral de ce manuel avant de commencer à l'utiliser.
2. L'expérience doit être strictement cloisonnée : zone de préparation pré-PCR-préparer les réactifs expérimentaux ; zone de traitement des échantillons - échantillons à tester, traitement des modèles ; zone de détection-amplification PCR, détection.
3. Pour les normes de gestion de laboratoire pertinentes, veuillez vous référer à la mise en œuvre des normes de gestion pour les laboratoires d'amplification génique émises par les autorités nationales compétentes.

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    Questions triviales : Listeria monocytogenes

    À propos de la listeria

    Définition Listeria

    Listeria est une bactérie anaérobie facultative qui est l'agent causal de la listériose. Listeria est une bactérie à Gram positif appartenant au phylum à paroi épaisse, du nom de Joseph Lister. Il utilise principalement la nourriture comme vecteur et est l'un des agents pathogènes d'origine alimentaire les plus mortels.

    Listeria est omniprésente dans l'environnement et peut être trouvée dans la plupart des aliments. La viande, les œufs, la volaille, les fruits de mer, les produits laitiers, les légumes, etc. se sont tous avérés être des sources d'infection à Listeria. L'intoxication par Listeria monocytogenes peut provoquer des infections du sang et des tissus cérébraux. De nombreux pays ont pris des mesures pour contrôler Listeria monocytogenes dans les aliments et ont établi des normes correspondantes.

    Sources de Listeria

    Listeria a été découverte pour la première fois en 1926 par un scientifique britannique d'origine sud-africaine Murray chez un lapin malade. En commémoration du père de la chirurgie de désinfection moderne, le physiologiste britannique Joseph Lister (1827-1912), en 1940, il a été nommé Listeria monocytogenes lors du 3e Congrès international de microbiologie.

    Espèces Listeria

    La Listeria monocytogenes reconnue internationalement possède les sept souches suivantes :
    Listeria monocytogenes, Listeria mutans, Listeria innocolus, Listeria welsii, Listeria sileri, Listeria monocytogenes, Listeria monocytogenes. Parmi eux, L. monocytogenes est le seul qui peut provoquer des maladies humaines. C'est un agent pathogène des maladies zoonotiques. Une intoxication grave peut provoquer des infections du sang et des tissus cérébraux. Listeria monocytogenes est abrégé en Listeria monocytogenes, qui est une bactérie Gram-positive et appartient au phylum à paroi épaisse.

    Infection à Listeria

    Dans le genre Listeria, seule Listeria monocytogenes peut provoquer des maladies telles que la méningite, la septicémie, les fausses couches et les infections néonatales chez l'homme. Si une personne immunodéficiente développe une infection à Listeria, la maladie est grave et le taux de mortalité peut atteindre 33 %.

    Symptômes de la listeria

    L'infection à Listeria peut s'accompagner de fièvre, de douleurs au cou, de vomissements ou de diarrhée. Des formes plus complexes peuvent également provoquer des encéphalites et des formes spécifiques de méningite. Les femmes enceintes sont également à risque de contracter Listeria. Les femmes enceintes sont 20 fois plus susceptibles d'être infectées par Listeria que les autres. Même s'il n'y a pas de fausse couche ou de mortinaissance, le nouveau-né peut avoir cette maladie infectieuse dès la naissance, il y a donc un taux de mortalité très élevé.

    Listeria monocytogenes

    Que sont les Listeria monocytogenes

    Listeria monocytogenes est un agent pathogène des maladies zoonotiques. Il peut provoquer la listériose chez les humains et les animaux. Après infection, elle se manifeste principalement par une septicémie, une méningite et des cellules mononucléées. La bactérie étant un parasite intracellulaire, son élimination par l'hôte dépend principalement de la fonction immunitaire cellulaire. Par conséquent, la listériose touche principalement les nouveau-nés, les personnes âgées et les personnes immunodéprimées. Listeria monocytogenes est principalement infectée par les selles et peut également pénétrer dans l'organisme par les yeux et la peau et les muqueuses endommagées pour provoquer une infection.

    Répartition de Listeria monocytogenes

    Listeria monocytogenes existe largement dans la nature, n'est pas facile à congeler et à décongeler et peut tolérer une pression osmotique plus élevée. Les bactéries sont présentes dans le sol, les eaux de surface, les eaux usées, les eaux usées, les plantes, l'ensilage, les légumes pourris, de sorte que les animaux peuvent facilement ingérer les bactéries.

    La voie de transmission de Listeria monocytogenes

    Listeria monocytogenes utilise principalement les aliments comme agent infectieux. C'est l'un des agents pathogènes d'origine alimentaire les plus mortels, causant la mort de 20 à 30 % des personnes infectées. Le taux de mortalité est encore plus élevé que celui de Salmonella et de Botox. Les gens mangent principalement du fromage à pâte molle, du poulet sous-chauffé, des hot-dogs non chauffés, du lait frais, du lait pasteurisé, de la crème glacée, du steak cru, des côtelettes d'agneau, de la salade de chou, du céleri, des tomates, des tartes françaises, de la langue de porc congelée, etc. Environ 80 à 90 % des cas sont causés par des aliments contaminés.
    Les bactéries peuvent pénétrer dans le corps par les yeux et endommager la peau et les muqueuses pour provoquer une infection. Après l'infection, les femmes enceintes infectent le fœtus ou le nouveau-né par le placenta ou le canal génital. Les bactéries qui habitent le vagin et le col de l'utérus peuvent également provoquer des infections. Le contact sexuel est également une voie possible de transmission de la maladie, et il y a une tendance à la hausse.

    Maladie à Listeria monocytogenes

    Symptômes de Listeria monocytogenes

    Le fait que Listeria monocytogenes tombe malade après être entré dans le corps humain est lié à la virulence de la bactérie ainsi qu'à l'âge et au statut immunitaire de l'hôte, car la bactérie est une bactérie parasite intracellulaire et son élimination par l'hôte dépend principalement de la fonction immunitaire cellulaire . Par conséquent, les personnes sensibles sont les nouveau-nés, les femmes enceintes et les adultes de plus de 40 ans. En outre, les alcooliques, les personnes dont le système immunitaire est endommagé ou défaillant, les patients recevant des agents immunosuppresseurs et des corticostéroïdes et les transplantés d'organes sont également susceptibles d'être infectés par la bactérie. Les manifestations cliniques de la maladie, les individus adultes en bonne santé présentent des symptômes pseudo-grippaux légers, les nouveau-nés, les femmes enceintes, les patients immunodéprimés avec essoufflement, vomissements, éruption hémorragique, conjonctivite suppurée, fièvre, convulsions, coma, avortement spontané, méningite, septicémie jusqu'à décès.

    Traitement de Listeria monocytogenes

    La pénicilline, l'ampicilline, la gentamicine, l'érythromycine, etc. peuvent être utilisées pour le traitement de l'infection à Listeria monocytogenes. L'érythromycine et d'autres antibiotiques à large spectre sont allergiques à la pénicilline.

    Prévention de Listeria monocytogenes

    Listeria monocytogenes peut survivre à un traitement thermique normal, le traitement thermique a tué la communauté bactérienne compétitive, ce qui facilite la survie de Listeria monocytogenes en l'absence de conditions environnementales compétitives. Ainsi, dans la transformation des aliments, la température centrale doit atteindre 70 °C pendant plus de 2 minutes. Listeria monocytogenes est répandue dans la nature, donc même si le produit a été surchauffé et transformé, la Listeria monocytogenes est totalement inactivée, mais elle peut provoquer une pollution secondaire du produit, donc après cuisson, éviter la pollution secondaire est extrêmement important. Étant donné que Listeria monocytogenes peut encore croître et se reproduire à 4 °C, les aliments non chauffés au réfrigérateur augmentent le risque d'intoxication alimentaire et les aliments au réfrigérateur doivent être chauffés avant d'être consommés.

    Test Listeria monocytogenes

    1. Méthode de culture bactérienne

    La méthode de test traditionnelle pour Listeria dans les aliments consiste à effectuer un pré-enrichissement ou un enrichissement sélectif et à utiliser les colonies suspectes isolées et cultivées pour des expériences de réaction biochimique, des expériences d'hémolyse et des expériences d'hémolyse coopérative (CAM P). Après Listeria monocytogenes a été davantage sérotypé. L'enrichissement et l'enrichissement sélectif sont des étapes indispensables dans cette méthode. Les méthodes d'enrichissement comprennent principalement : la méthode d'enrichissement à froid et la méthode de culture à température normale. La méthode d'enrichissement à froid est cultivée à 4°C pendant 30 jours, parfois même jusqu'à un an. A température ambiante, les bactéries doivent être cultivées pendant 24h à 7j. Par conséquent, la méthode de détection traditionnelle nécessite 7 à 11 jours pour isoler et identifier Listeria monocytogenes, de sorte que la période de détection de la méthode traditionnelle est plus longue.

    2. Agglutination sérique

    Selon les antigènes bactériens et les antigènes flagellaires, la LM est divisée en 16 sérotypes : 1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 5, 6a, 6b , 7. La structure de l'antigène n'a rien à voir avec la virulence. Les principaux facteurs pathogènes pour l'homme sont les sérotypes 1/2a, 1/2b et 4b, qui représentent environ 90 % des cas mondiaux de cette maladie.

    3. Méthodes de test de biologie moléculaire

    3 .1 Technologie de détection de sonde
    Cette technologie est le premier organisme moléculaire utilisé dans la détection de Listeria
    Apprendre la technologie. Dès 1988, Atin et al. cloné et séquencé un fragment d'ADN de 500 pb du gène de la bêta-hémolysine de Listeria, et synthétisé quatre sondes oligonucléotidiques à partir de cette séquence, marqué la sonde au 32P et réalisé une expérience d'hybridation par points. Il a été confirmé que la sonde ne réagissait qu'avec Listeria monocytogenes, et il était négatif avec d'autres espèces de Listeria et des bactéries hors genre, montrant une bonne spécificité.

    3.2 Technologie de détection par réaction en chaîne par polymérase (PCR)
    Le développement de la PCR est assez avancé, et il est largement utilisé dans la détection de Listeria. Les amorces spécifiques à l'amplification PCR sont conçues sur la base de la séquence spécifique du gène de virulence de Listeria monocytogenes, et une est conçue sur la base de la séquence spécifique dans le génome de Listeria monocytogenes. Les séquences cibles couramment utilisées sont les gènes de virulence tels que hly A, iap, inl, Dth-18. L'avantage d'utiliser la méthode PCR pour détecter Listeria est la spécificité de la méthode, mais l'inconvénient est la faible sensibilité ; la culture de l'échantillon est amplifiée après extraction chimique, ce qui améliore le taux de détection de l'échantillon ; et peut Une Listeria monocytogenes "vivante, non cultivable" n'a pas pu être détectée par les méthodes d'enrichissement traditionnelles.

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