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Qu'est-ce que l'immunochromatographie ?
Le principe de l'immunochromatographie
La méthode de dosage couramment utilisée en immunochromatographie
Les particules couramment colorées utilisées en immunochromatographie
Qu'est-ce que l'or colloïdal ?
La méthode de dosage des 3 types basée sur l'immunochromatographie à l'or colloïdal
Les matières premières utilisées dans le développement de l'immunochromatographie
L'équipement utilisé dans le développement de l'immunochromatographie
La procédure de fabrication dans le développement de l'immunochromatographie
Comment utiliser l'immunochromatographie à l'or colloïdal pour la détection de la sécurité alimentaire ?
Conclusion
Immunochromatographie (immunochromatography assay, ICA) est un nouveau type de méthode de dosage immunologique apparu au début des années 1980. Il s'agit d'un immunoessai simple et rapide établi sur la base de l'immunofiltration (IFA).
Le principe de l'immunochromatographie est de fixer un anticorps spécifique sur une certaine zone du membrane de nitrocellulose. Lorsque l'extrémité sèche de nitrocellulose est immergée dans l'échantillon (analyte), en raison de l'action capillaire, l'échantillon avance le long de la membrane, lors du déplacement vers la zone où l'anticorps est fixé, l'antigène correspondant dans l'échantillon se lie spécifiquement à l'anticorps . Si elle est colorée avec de l'immunogold ou de l'immunoenzyme, la zone peut montrer une bande de couleur pour obtenir un immunodiagnostic spécifique.
La technologie RIA utilise des antigènes ou des anticorps marqués avec des isotopes radioactifs (tels que 125I, zhi32P, 3H, etc.) La technologie. Il comprend un dosage radio-immunologique caractérisé par un antigène marqué et un dosage immunoradiométrique (IRMA) caractérisé par un anticorps marqué. Le premier utilise principalement la méthode de liaison compétitive en phase liquide, qui mesure à la fois les antigènes macromoléculaires et les antigènes à petites molécules ; ce dernier utilise la méthode en phase solide pour mesurer les antigènes macromoléculaires.
Le RIA occupe une grande place dans les premières méthodes de dosage immunologique des pesticides et a établi le rayonnement de la dieldrine, de l'aldrine, du 2,4-D et du 2,4,5-T, du parathion et du paraquat. Immunoessai. Bien que cette méthode soit très sensible (RIA est généralement de 10-9g, 10-12g ou même 10-15g) et a un large éventail d'applications, des compteurs coûteux sont nécessaires pour effectuer RIA, et il y a aussi des problèmes tels que le rayonnement et la pollution . L'application et le développement du domaine de la détection sont soumis à certaines restrictions, et sont progressivement remplacés par d'autres méthodes d'immunodosage.
L'EIA est une technologie de dosage immunologique développée après RIA. Le principe de détection est similaire à celui du dosage radio-immunologique, mais le marqueur utilisé est une enzyme, qui combine organiquement la réaction immunitaire spécifique des antigènes et des anticorps avec la catalyse à haute efficacité des enzymes. L'activité de l'enzyme liée à la phase solide est mesurée pour déterminer la mesure de la quantité de substance. Les enzymes utilisées comme marqueurs comprennent la peroxydase de raifort (HRP) et la phosphatase alcaline (AKP), la glucose oxydase (GO), l'uréase (uréase) et ainsi de suite.
Le support solide pour la réaction de marquage enzymatique comprend des tubes et des membranes en plastique polystyrène. Actuellement, la plupart des plaques de microtitration 96 puits (MTP) sont utilisées comme support solide. Ce type de plaque a une grande capacité de détection et un grand nombre d'échantillons, et seul un simple lecteur de microplaque peut obtenir des données de détection précises. Certains chercheurs utilisent également des billes magnétiques comme matériaux en phase solide pour la recherche EIA. Le principe est d'envelopper des matériaux polymères (polystyrène, polychlorure de vinyle, etc.) à l'extérieur de petites particules métalliques (Fe2O3, Fe3O4), puis de les lier chimiquement avec des groupements aminés. (-NH2), carboxyle (-COOH), hydroxyle (-OH) et d'autres groupes actifs sont couplés avec des anticorps ou des antigènes pour fabriquer des billes immunitaires. Les avantages de cette méthode sont que les microbilles ont une grande surface spécifique, une forte capacité d'adsorption et peuvent être mises en suspension dans la phase liquide pour capturer rapidement et uniformément l'analyte dans l'échantillon. Après application d'un champ magnétique, les microbilles peuvent être rapidement séparées de la solution échantillon, réduisant ainsi la détection. Temps, améliorer la sensibilité de détection.
Étant donné que les réactifs marqués par une enzyme sont faciles à préparer, stables et peu coûteux, et que la sensibilité du dosage immunoenzymatique est proche de celle de la technologie radio-immune, la technologie EIA s'est développée rapidement ces dernières années et diverses méthodes EIA ont été développées. Parmi eux, le dosage immunoenzymatique (enzymelinked immunosorbent assay, ELISA) est actuellement la technique de dosage immunoenzymatique la plus utilisée dans la détection des résidus de pesticides.
Le principe de base de la détection FIA est de combiner organiquement la haute spécificité des antigènes et des anticorps avec la mesurabilité sensible de la fluorescence, et d'utiliser des substances fluorescentes comme traceurs pour marquer des anticorps, des antigènes ou des molécules d'haptène afin de préparer des réactifs fluorescents spécifiques de haute qualité. Lorsque la substance fluorescente dans le conjugué antigène-anticorps est irradiée par de la lumière ultraviolette ou de la lumière bleue, elle peut absorber l'énergie lumineuse et entrer dans un état excité. Lorsqu'il revient à l'état fondamental à partir de l'état excité, il peut émettre l'énergie lumineuse absorbée sous forme de rayonnement électromagnétique, entraînant une fluorescence. Le tracé d'une courbe d'intensité de concentration-fluorescence des pesticides peut détecter qualitativement et quantitativement les résidus de pesticides dans les échantillons.
La fluorescéine adaptée au marquage d'anticorps, d'antigènes ou de molécules d'haptène doit répondre aux exigences :
Le LCIA peut être divisé en dosage immunologique chimiluminescent (dosage immunologique chimiluminescent, CLCIA) et dosage immunologique bioluminescent (dosage immunologique bioluminescent, BLCIA).
En 1976, Shroeder a établi pour la première fois une technologie de dosage immunologique par chimiluminescence homogène utilisant le système biotine (B)-avidine (A). Par la suite, Halman et Velan l'ont étendu aux systèmes hétérogènes, qui ont maintenant été infiltrés dans la recherche biologique. Champs variés. Le principe est d'indiquer la combinaison de antigène et anticorps par luminescence. Lorsque le marqueur luminescent est associé à l'anticorps ou à l'antigène correspondant, le substrat réagit avec l'enzyme, ou une réaction redox avec l'agent luminescent ou la substance fluorescente (telle que le rubrène, etc.) Excitent et libèrent de l'énergie lumineuse. Enfin, l'intensité lumineuse a été mesurée avec un photomètre pour une analyse quantitative. Les marqueurs luminescents couramment utilisés sont la peroxydase de raifort (HRP), le luminol (luminol), l'isoluminol (isoluminol), la lophine (lophine), le lucigen (lucigen), le double (2, 4, 6) -Trichlorobenzène) oxalate, le biphényltriol et le 6[N- (4-diaminobutyl)-N-éthyl]-amino-2,3-dihydrophénazine-1,4-dione (ABEI) etc. Lorsque l'anticorps (ou l'antigène) marqué avec le marqueur luminescent susmentionné est associé à l'antigène correspondant (ou anticorps) dans une certaine solution tampon à pH, il émettra de la lumière sous l'action d'un facteur coopérant (tel que H2O2, etc.) et son intensité lumineuse sera la même que celle de la substance d'essai. Il est proportionnel à la concentration, il peut donc être utilisé pour une analyse quantitative.
Le dosage immunologique par luminescence présente les avantages d'une forte spécificité, d'une sensibilité élevée (limite de détection de 10 à 15 mol/L), d'une rapidité (1～3h) et d'une disponibilité aisée des matériaux luminescents. Cependant, son processus de luminescence et son intensité sont souvent affectés par la structure chimique de la substance luminescente elle-même, le pH du milieu, la substance columinescente et les impuretés des ions métalliques.
Le principe de la détection GICA est d'enrober les ligands (anticorps ou antigènes) sur une membrane microporeuse telle que des membranes de nitrocellulose sous une forme linéaire. L'étiquette en or colloïdal est également fixée avec des ligands ou d'autres substances à l'état sec sur le matériau absorbant. L'action capillaire fait nager la solution échantillon sur la bande chromatographique. Lorsqu'elle nage jusqu'au marqueur d'or colloïdal, si l'échantillon contient le récepteur à tester, la première étape est une réponse immunitaire hautement spécifique pour former un complexe immun. Lorsque la substance continue à nager vers la zone de revêtement linéaire, la deuxième étape de une réponse immunitaire spécifique se produit, et le complexe immun formé est piégé dans la zone linéaire revêtue, et la bande rouge est représentée par l'or colloïdal marqué (bande de détection), tandis que l'étiquette libre traverse la bande de détection et est automatiquement séparée de l'étiquette liée . Une détermination qualitative ou quantitative peut être réalisée en détectant la présence ou l'absence de couleur ou la nuance de la couleur sur la bande2.
La méthode GICA présente les avantages d'avoir des résultats rapides (5-20 minutes), bon marché et clairs, aucune compétence d'exploitation compliquée ni équipement spécial, et facile à transporter. Cependant, par rapport à d'autres méthodes de dosage immunologique, la sensibilité de détection de cette méthode est légèrement inférieure et elle convient principalement à une détermination qualitative ou semi-quantitative rapide sur site. À l'heure actuelle, cette méthode a été utilisée dans de nombreux domaines de recherche tels que la médecine et la biologie, et a été largement utilisée en particulier dans les pays développés.
L'utilisation d'une seule technique d'IA pour analyser les résidus de pesticides contient moins d'informations et la sélectivité des méthodes d'analyse physique et chimique est relativement faible. Kramer et al. ont utilisé des dosages immunologiques et la chromatographie liquide (LC) en combinaison, simplifiant ainsi la méthode d'analyse et améliorant l'efficacité de détection. La combinaison de LC-IA combine la capacité de séparation élevée de la LC avec la haute sensibilité et la haute spécificité de l'IA. Cette méthode d'analyse est particulièrement adaptée à l'analyse de résidus multi-composants et à la microanalyse. La combinaison du dosage immunologique et de la chromatographie en phase gazeuse ou de la spectrométrie de masse (GC ou MS) peut réduire les réactions croisées dans l'analyse de pesticides ou de métabolites ayant des structures similaires afin de réduire les faux positifs.
Nanoparticule d'or colloïdal
Particule de latex
Particule de carbone
Perles magnétiques
Colorants fluorescents
Points quantiques
Conversion ascendante luminescente
Or colloïdal, également connu sous le nom de nanoparticules d'or, est une suspension stable, uniforme et à dispersion unique de particules d'or en suspension dans un liquide après la réduction du sel d'or en or. Les particules d'or sont composées d'un atome d'or et d'une double couche ionique qui l'entoure.
La couleur de la solution dépend de la couleur du matériau en phase dispersée, de la dispersion du matériau en phase dispersée et du type de lumière incidente, qu'il s'agisse de lumière diffusée ou de lumière transmise. Plus les particules sont petites et plus la dispersion est élevée, plus la longueur d'onde de la lumière diffusée est courte. Pour l'hydrolat de la même substance, la taille des particules est différente et la couleur est également différente.
Par exemple, la taille des particules d'or colloïdal entre 5 et 20 nm, la longueur d'onde d'absorption de 520 nm, sont de couleur vin rouge ; la taille comprise entre 20 et 40 nm absorbe principalement la lumière verte avec une longueur d'onde de 530 nm et la solution est rouge foncé; la particule d'or colloïdal de 60 nm absorbe principalement la lumière orange de 600 nm de longueur d'onde, la solution est bleu-violet. Les particules d'or colloïdal généralement utilisées en immunohistochimie sont de l'ordre de 5 à 60 nm et la solution apparaît en rouge.
La particule colorée la plus populaire est la nanoparticule d'or. Technologie d'or colloïdal qui combine la réponse immunitaire antigène-anticorps et la technologie de marquage à l'or colloïdal pour la détection qualitative et quantitative de la teneur en antigène et en anticorps. En raison de ses avantages tels que la rapidité, la simplicité, le faible coût et la bonne stabilité, la détection d'or colloïdal a été largement utilisée dans le domaine de la détection clinique.
À l'heure actuelle, les méthodes de détection couramment utilisées des plates-formes de détection d'or colloïdal comprennent la méthode sandwich à double anticorps, la méthode de compétition et la méthode indirecte. Il existe de grandes différences entre la méthode de dosage et les analytes.
La méthode sandwich à double anticorps est la méthode de détection la plus couramment utilisée pour les plates-formes de détection d'or colloïdal, qui est principalement utilisée pour détecter des biomolécules relativement grandes et des antigènes particulaires. La méthode sandwich à double anticorps nécessite la préparation de l'anticorps apparié de l'antigène à tester. Un anticorps est marqué à l'or colloïdal et fixé sur le tampon conjugué, et l'autre anticorps est fixé sur la ligne de détection (ligne T) de la membrane NC. De plus, il est nécessaire de préparer un anticorps secondaire qui se lie spécifiquement à l'anticorps marqué à l'or (c'est-à-dire l'anticorps marqué à l'or colloïdal) et de le fixer sur la ligne de contrôle (ligne C) de la membrane NC.
Lorsque l'échantillon a été ajouté à la bandelette, il se déplacera vers le tampon d'échantillon, le tampon conjugué, la ligne T, la ligne C et le tampon absorbant (tampon absorbant) en séquence grâce au principe du flux capillaire. La réaction de chaque étape est indiquée dans le tableau suivant :
| Sample move T conjugué pad | Exemple de déplacement vers la ligne T | Exemple de passage à la ligne C | Résultats | |
|---|---|---|---|---|
| Anaylte contient l'antigène | Antigène capturé par un anticorps marqué à l'or, devient un complexe | L'anticorps de la ligne fixe sur T capturera le complexe et la bande de couleur sera visible | L'anticorps secondaire capturera l'anticorps marqué à l'or et la bande de couleur visible | Deux lignes visibles |
| Anaylte sans antigène | Pas de réaction | Aucun changement de couleur | Idem ci-dessus | Seule la ligne C visible |
Par conséquent, lorsque deux lignes rouges sont affichées sur la bandelette, cela signifie que la substance à tester dans l'échantillon est positive ; lorsqu'il n'y a que la ligne C sur la bande, cela signifie que la substance à tester dans l'échantillon est négative. La concentration élevée de la substance aura une bande de couleur plus forte de la ligne T.
Les antigènes à petites molécules sont difficiles à préparer des anticorps appariés (poids moléculaire trop petit, il est difficile de trouver deux sites de liaison pour que deux anticorps se lient en même temps), de sorte que les antigènes à petites molécules ne peuvent pas être détectés par la méthode sandwich à double anticorps. Pour les antigènes à petites molécules, utilisez généralement la méthode de compétition pour le dosage.
Dans la méthode de compétition, l'anticorps marqué à l'or est fixé sur le coussinet cojugué o, et la ligne T sur la membrane NC est fixée avec l'antigène couplé macromoléculaire à tester (les antigènes à petites molécules ne peuvent pas être directement fixés sur la membrane NC. Par conséquent , il est nécessaire de coupler chimiquement de petites molécules à la BSA et à d'autres substances macromoléculaires puis de les immobiliser sur la membrane NC). Le deuxième anticorps qui peut spécifiquement se lier à l'anticorps marqué à l'or est immobilisé sur la lignée C.
Lorsque l'échantillon a été ajouté à la bandelette, il se déplacera vers le tampon d'échantillon, le tampon conjugué, la ligne T, la ligne C et le tampon absorbant (tampon absorbant) en séquence grâce au principe du flux capillaire. La réaction de chaque étape est indiquée dans le tableau suivant :
| Sample move T conjugué pad | Exemple de déplacement vers la ligne T | Exemple de passage à la ligne C | Résultats | |
|---|---|---|---|---|
| Anaylte contient l'antigène | Antigène capturé par un anticorps marqué à l'or, devient un complexe | Aucun antigène ne peut être capturé. Pas de bande de couleur | L'anticorps secondaire capturera l'anticorps marqué à l'or et la bande de couleur visible | Seule la ligne C visible |
| Anaylte sans antigène | Pas de réaction | Capturez l'anticorps marqué à l'or et la bande de couleur visible | Idem ci-dessus | Deux lignes visibles |
Par conséquent, lorsque deux lignes rouges sont affichées sur la bandelette, cela signifie que la substance à tester dans l'échantillon est négative ; lorsqu'il n'y a que la ligne C sur la bande, cela signifie que la substance à tester dans l'échantillon est positive. La concentration élevée de la substance aura une bande de couleur plus forte de la ligne T.
La méthode indirecte est principalement utilisée pour détecter les anticorps. En cas de méthode indirecte, le tampon conjugué se fixe avec la protéine A marquée à l'or colloïdal (la protéine A peut se lier à l'anticorps de manière non spécifique). La ligne T sur la membrane NC est fixée avec un antigène qui peut se lier spécifiquement à l'anticorps à tester, et la ligne C sur la membrane NC est fixée avec un anticorps anti-Protéine A.
Lorsque l'échantillon a été ajouté à la bandelette, il se déplacera vers le tampon d'échantillon, le tampon conjugué, la ligne T, la ligne C et le tampon absorbant (tampon absorbant) en séquence grâce au principe du flux capillaire. La réaction de chaque étape est indiquée dans le tableau suivant :
| Sample move T conjugué pad | Exemple de déplacement vers la ligne T | Exemple de passage à la ligne C | Résultats | |
|---|---|---|---|---|
| Anaylte contient des anticorps | Anticorps capturé à la protéine A marqué à l'or, devenu un complexe | Anticorps de capture d'antigène, bande de couleur visible | Protéine A capturée par l'anticorps anti-protéine A et bande de couleur visible | Deux lignes visibles |
| Analyse sans anticorps | Pas de réaction | L'antigène ne peut pas capturer l'antigène, la couleur ne change pas | L'anticorps marqué à l'or capturé par l'anticorps secondaire, bande de couleur visible | Seule la ligne C visible |
Par conséquent, lorsque deux lignes rouges sont affichées sur la bandelette, cela signifie que la substance à tester dans l'échantillon est positive ; lorsqu'il n'y a que la ligne C sur la bande, cela signifie que la substance à tester dans l'échantillon est négative. La concentration élevée de la substance aura une bande de couleur plus forte de la ligne T.
Plus de détails, veuillez vous référer à Comment développer un test rapide de dosage du flux latéral?
Comment automatiser l'assemblage pour un test rapide?
Immunochromatographie à l'or colloïdal largement utilisé dans les tests alimentaires depuis de nombreuses années. Par exemple, comment le essai de lait travailler sur les résidus d'antibiotiques dans le lait cru ?
L'antibiotique étant une petite molécule, le dosage choisit la méthode de compétition. Quel est le mécanisme de réaction ?
Voyons la structure de la bande:
L'anticorps marqué à l'or colloïdal lyophilisé dans plaques de puits. Séparation de la bande, augmente le temps d'incubation et améliore la sensibilité de détection.
Mécanisme de réaction d'écoulement latéral
La méthode colorimétrique pour l'interprétation du test du lait. La ligne de test est comparée à la ligne de contrôle pour déterminer un résultat positif ou négatif. Lors de la fabrication pour contrôler la quantité d'Au-Ab pour réaliser un dosage colorimétrique.
Immunochromatographie est une technologie d'analyse très populaire, largement utilisée dans les produits de diagnostic in vitro, non seulement utilisée dans les tests alimentaires. En particulier dans le test à flux latéral, le test d'immunochromatographie à l'or colloïdal n'a pas besoin d'équipement coûteux, facile à utiliser, à moindre coût pour aider l'être humain à mieux vivre, par exemple, un test de grossesse à domicile.
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