Principe de la PCR en temps réel
Structure de l'étamipride
La PCR quantitative par fluorescence en temps réel est une méthode de mesure de la quantité totale de produits après chaque cycle de réaction en chaîne par polymérase (PCR) à l'aide de produits chimiques fluorescents dans une réaction d'amplification de l'ADN. Méthode d'analyse quantitative de séquences d'ADN spécifiques dans un échantillon à tester par des méthodes de référence internes ou externes.
La PCR en temps réel est la détection en temps réel du processus PCR via le signal fluorescent pendant le processus d'amplification PCR. En raison de la relation linéaire entre la valeur Ct de la matrice et le nombre de copies initiales de la matrice pendant la période exponentielle de l'amplification PCR, elle devient la base de la quantification.
Le principe de base de la technologie PCR est similaire au processus de réplication naturel de l'ADN, et sa spécificité dépend des amorces oligonucléotidiques complémentaires aux deux extrémités de la séquence cible.
Réactifs PCR
Kit PCR comprenant une matrice d'acide nucléique purifiée, un désoxyribonucléotide (dNTP), des amorces oligonucléotidiques et une ADN polymérase. La purification des acides nucléiques et l'évaluation de la qualité sont des étapes importantes du processus d'expérimentation PCR. Il est important d'utiliser des techniques appropriées pour isoler et purifier les acides nucléiques des matières premières, car cette étape affectera la réaction d'amplification.
L'ADN polymérase catalyse l'ajout de dNTP aux brins d'ADN étendus en ajoutant des bases complémentaires au brin matrice. L'identification d'ADN polymérases thermostables et les modifications ultérieures de ces enzymes jouent un rôle clé dans le développement et l'adoption généralisée de la réaction PCR.
réaction PCR
Cinq éléments de la réaction PCR : Il existe cinq types de substances qui participent à la réaction PCR : les amorces (les amorces PCR sont des fragments d'ADN et les amorces pour la réplication de l'ADN dans la cellule sont un brin d'ARN), les enzymes, les dNTP, les matrices et les tampons dont Mg2+ est requis).
Étapes de la PCR
Le processus PCR standard est divisé en trois étapes :
Dénaturation de l'ADN : (90℃-96℃) : matrice d'ADN double brin sous l'action de la chaleur, la liaison hydrogène se rompt pour former un ADN simple brin.
Recuit : (60℃-65℃) : La température du système est réduite et les amorces sont combinées avec la matrice d'ADN pour former un double brin local.
Extension : (70℃-75℃) : Sous l'action de l'enzyme Taq (environ 72℃, la meilleure activité), le dNTP est utilisé comme matière première, en partant de l'extrémité 3′ de l'amorce et en s'étendant de la 5′→ 3′ fin. Synthétiser des brins d'ADN complémentaires à la matrice.
Chaque cycle subit une dénaturation, un annelage et une extension, et la teneur en ADN double. Maintenant, certaines PCR ont une courte région d'amplification, et même si l'activité de l'enzyme Taq n'est pas optimale, elles peuvent être répliquées en peu de temps, ce qui permet de passer à une méthode en deux étapes, c'est-à-dire que l'annelage et l'extension sont effectué à 60℃-65℃ en même temps. Afin de réduire le processus d'élévation et de chute de température, la vitesse de réaction est augmentée.
Résultats PCR et analyse PCR
1. S'il existe une courbe standard bai, calculez en fonction de la courbe standard. du
2. Généralement, la quantité relative est calculée par la méthode delta delta CT.
3. Les exemples sont les suivants : la valeur CT du gène A dans le groupe dao témoin est de 20 et la valeur CT du contrôle interne (comme la actine) est de 15. La valeur CT du gène A dans le groupe expérimental était de 18, et la valeur CT de la référence interne était de 14.
4. Calculez d'abord le volume d'échantillon : delta CT=15-14=1. La puissance de 2 est 2. En d'autres termes, le volume d'échantillon du groupe expérimental est le double de celui du groupe témoin. Gène A : delta CT=20-18=2. La puissance de 2 est 4. En d'autres termes, la quantité de gène A dans le groupe expérimental était 4 fois supérieure à celle du groupe témoin. Cependant, étant donné que la quantité d'échantillon ajoutée est double, donc 4 = 2 = 2, la quantité relative finale est de 2 fois.
5. Quelques points : La spécificité de l'amplification doit être déterminée. Seule la valeur CT d'une même cible peut être soustraite (l'efficacité d'amplification peut être différente). La puissance de 2 n'est que la valeur théorique et l'efficacité d'amplification réelle est inférieure à 2. Syber Green.
Applications PCR
La PCR est généralement appliquée aux aspects suivants :
1. Recherche fondamentale sur les acides nucléiques : clonage du génome
2. PCR asymétrique pour préparer du ADN simple brin pour le séquençage de l'ADN
3. PCR inverse pour déterminer les régions d'ADN inconnues
4. La daoPCR de transcription inverse (RT-PCR) est utilisée pour détecter le niveau d'expression des gènes dans les cellules, la quantité de virus à ARN et cloner directement l'ADNc de gènes spécifiques
5. La PCR quantitative par fluorescence est utilisée pour la surveillance en temps réel des produits PCR
6. Amplification rapide des extrémités d'ADNc
7. Détection de l'expression des gènes
8. Applications médicales : détection des maladies bactériennes et virales ; diagnostiquer les maladies génétiques; diagnostiquer les tumeurs; application à la médecine légale.
Machine PCR
La machine PCR est également appelée amplificateur de gènes PCR, amplificateur d'acide nucléique PCR, amplificateur d'acide nucléique à réaction en chaîne par polymérase, c'est une sorte d'instrument et d'équipement qui utilise la technologie PCR (réaction en chaîne par polymérase, réaction en chaîne par polymérase) pour amplifier l'ADN spécifique. dans les laboratoires médicaux et biologiques, par exemple, pour déterminer si l'échantillon présentera une carte de maladie génétique, un diagnostic de maladie infectieuse, une réplication génique et un test de paternité.
PCR inc.
Les principales entreprises présentées sur le marché mondial de la PCR de diagnostic sont les suivantes : Abbott Laboratories,
Agilent Technologies Inc.,
Alere Inc., Asuragen Inc.,
Groupe Biocartis Nv, Biofire Diagnostics LLC. (racheté par Biomerieux),
Biomerieux SA,
Laboratoires Bio-Rad inc.,
Cepheid (une société Danaher),
Diagnostic Genmark Inc.,
Hologic Inc., Luminex Corporation,
Méridien Bioscience Inc.,
Qiagen SA,
Groupe Quantumdx,
Roche,
Bioscience spartiate,
T2 Biosystèmes
