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La inmunohistoquímica ( IHC ), también conocida como inmunocitoquímica , se refiere a una nueva tecnología que permite la determinación cualitativa, localizada y cuantitativa de los antígenos correspondientes mediante la reacción antígeno-anticuerpo y la reacción de color histoquímica in situ en las células del tejido, utilizando anticuerpos específicos marcados con un reactivo cromogénico.
Combina ingeniosamente la especificidad de la respuesta inmunitaria con la visibilidad de la histoquímica. Mediante la obtención de imágenes y la magnificación de microscopios (incluidos microscopios de fluorescencia y electrónicos), permite detectar diversas sustancias antigénicas (como proteínas , polipéptidos, enzimas, hormonas, patógenos y receptores, entre otros). La tecnología de inmunohistoquímica se ha desarrollado rápidamente en los últimos años. En la década de 1950, se limitaba a la tecnología de inmunofluorescencia. Desde entonces, se ha desarrollado gradualmente una tecnología inmunoenzimática altamente sensible y más práctica.
La unión entre anticuerpo y antígeno posee un alto grado de especificidad, y la inmunohistoquímica aprovecha este principio. En primer lugar, se extrae una sustancia química específica del tejido o célula y se utiliza como antígeno o hapteno. Tras inmunizar al animal, se obtiene un anticuerpo específico, que posteriormente se emplea para detectar la misma sustancia antigénica en el tejido o célula. Dado que el complejo antígeno-anticuerpo es incoloro, es necesario visualizar el sitio de unión mediante histoquímica para realizar estudios cualitativos, localizados o cuantitativos de antígenos desconocidos en tejidos o células.
A. Fuerte especificidad
El principio básico de la inmunología establece que la unión entre antígeno y anticuerpo es altamente específica. Por lo tanto, la inmunohistoquímica es, en teoría, una técnica específica para la identificación de antígenos en las células tisulares. Por ejemplo, la queratina muestra los componentes epiteliales y el LCA muestra los linfocitos. Solo cuando existen antígenos cruzados en las células tisulares se producen reacciones cruzadas.
B. Alta sensibilidad
En la etapa inicial de la aplicación de la inmunohistoquímica , debido a limitaciones técnicas, solo se disponía del método directo, el método indirecto y otras tecnologías menos sensibles. En aquel entonces, el anticuerpo solo podía diluirse unas pocas o decenas de veces; ahora, la llegada del método ABC o SP permite diluir los anticuerpos miles, decenas de miles o incluso cientos de millones de veces, y el anticuerpo aún puede unirse a los antígenos en las células tisulares. Esta reacción anticuerpo-antígeno de alta sensibilidad hace que los métodos de inmunohistoquímica sean cada vez más convenientes para el diagnóstico patológico de rutina.
C.Posicionamiento preciso, combinación de forma y función
Esta tecnología permite localizar con precisión antígenos en tejidos y células mediante reacciones antígeno-anticuerpo y de color, de modo que se pueden identificar y observar diferentes antígenos simultáneamente en el mismo tejido o célula. Así, se puede estudiar la combinación de morfología y función, lo cual resulta fundamental para realizar investigaciones exhaustivas en el campo de la patología.
A. espécimen
Los experimentos utilizan principalmente muestras de tejido y de células. Las primeras incluyen secciones incluidas en parafina (secciones patológicas y fragmentos de tejido) y secciones congeladas, y las segundas incluyen impresiones de tejido, portaobjetos celulares y frotis celulares.
Entre ellos, la sección de parafina es el método más común y básico para preparar muestras de tejido. Se conserva bien para la morfología del tejido y se puede utilizar para cortes seriados, lo que facilita diversas observaciones de control de tinción; también se puede archivar durante mucho tiempo para investigaciones retrospectivas; tendrá cierto impacto en la exposición de antígenos, pero se puede realizar la recuperación de antígenos , que es el método preferido de preparación de muestras de tejido en inmunohistoquímica.
B. anticuerpo
Los anticuerpos más utilizados en experimentos de inmunohistoquímica son los anticuerpos monoclonales y los policlonales. Los anticuerpos monoclonales son secretados por un clon de linfocito B y se preparan mediante la inmunización de animales con la tecnología de hibridoma por fusión celular. El anticuerpo policlonal es un suero inmune obtenido de la sangre animal tras la inmunización directa con el antígeno purificado. Es una mezcla de anticuerpos producidos por múltiples clones de linfocitos B.
C.Métodos de teñido habituales
Según los diferentes marcadores, se divide en inmunofluorescencia , marcaje inmunoenzimático e histoquímica de afinidad. Este último método de detección se basa en una sustancia con alta afinidad por un componente tisular específico. Es más sensible y facilita la localización de antígenos traza (anticuerpos) a nivel celular o subcelular. Entre ellos, la tinción con biotina-avidina es la más utilizada.
La tinción inmunohistoquímica desempeña un papel fundamental en la investigación biomédica y abarca numerosos campos de investigación. Sin embargo, esta tecnología también presenta limitaciones. Por ejemplo, la sustancia de prueba en las células del tejido debe ser antigénica y se requiere una concentración específica. Además, no es posible determinar si la proteína inmunorreactiva detectada es de reciente síntesis celular o se transporta a través de las células.
Por lo tanto, estas características deben considerarse detenidamente en el diseño experimental. Si el experimento requiere demostrar qué tipo de célula sintetiza la proteína conocida, se prefiere la tecnología de hibridación in situ molecular . Para guiar a los principiantes en el uso razonable y hábil de la tecnología de inmunohistoquímica en el diseño experimental, a continuación se describen brevemente los principios básicos de su aplicación:
Es la técnica de inmunohistoquímica más antigua que se ha establecido. Se basa en el principio de la unión específica antígeno-anticuerpo. Primero, el anticuerpo conocido se marca con fluoresceína, que se utiliza como sonda para detectar el antígeno correspondiente en la célula o el tejido. Al observarlo bajo un microscopio de fluorescencia, la fluorescencia del complejo antígeno-anticuerpo se irradia con luz de excitación, emitiendo fluorescencia de una longitud de onda determinada. De esta forma, se puede determinar la localización de un antígeno específico en el tejido y realizar un análisis cuantitativo. Gracias a su alta especificidad, sensibilidad, rapidez y sencillez, la tecnología de inmunofluorescencia se utiliza ampliamente en el diagnóstico y análisis clínico-patológico.
Aplicación
El método de marcaje inmunoenzimático es una técnica desarrollada en la década de 1960, posterior a la inmunofluorescencia . El principio básico consiste en utilizar primero anticuerpos marcados con enzimas para interactuar con tejidos o células, y luego añadir sustratos enzimáticos para generar productos o partículas insolubles coloreadas con una determinada densidad electrónica.
Mediante microscopía óptica o electrónica, varios tipos de superficies celulares y componentes antigénicos en las células están sujetos a investigación de localización. La tecnología de etiquetado de inmunoenzimas es la tecnología más utilizada. Las principales ventajas de este método en comparación con la tecnología de inmunofluorescencia son: posicionamiento preciso, buen contraste, conservación a largo plazo de las muestras teñidas y adecuado para estudios de microscopía óptica y electrónica.
El método de marcado con inmunoenzimas se ha desarrollado muy rápidamente y se han derivado una variedad de métodos de marcado. Con la mejora continua y la innovación del método, su especificidad y sensibilidad se han mejorado enormemente, más conveniente de usar. El método ABC, el método de tres pasos SP, los sistemas de detección de método de dos pasos listos para usar se utilizan ampliamente en el diagnóstico patológico.
Aplicación
La tecnología inmunológica de oro coloidal utiliza partículas metálicas especiales, como el oro coloidal, como marcador. El oro coloidal se refiere al hidrosol de oro, que adsorbe proteínas de forma rápida y estable sin afectar significativamente su actividad biológica . Por lo tanto, al usar anticuerpos primarios , secundarios u otras moléculas marcadas con oro coloidal que se unen específicamente a inmunoglobulinas (como la proteína A estafilocócica) como sondas, se pueden localizar cualitativamente, e incluso cuantificar, antígenos en tejidos o células.
Dado que el oro coloidal tiene partículas de diferentes tamaños y la densidad electrónica del oro coloidal es alta, la técnica del oro inmunocoloidal es particularmente adecuada para estudios de localización de marca única o marca múltiple de microscopía inmunoelectrónica. Y debido al color del oro coloidal de rojo claro a rojo oscuro, también es adecuado para la observación con microscopio óptico. Por ejemplo, la aplicación de la ley de la plata e inmuno-oro mejorada con plata es más conveniente para la observación con microscopio óptico.
Debido a sus características únicas, la inmunohistoquímica se ha convertido en una técnica frecuentemente elegida por la mayoría de los investigadores científicos para el análisis de células tisulares y la investigación cualitativa y cuantitativa. Por lo tanto, con la actualización de las herramientas de investigación científica, los científicos necesitan comprender la inmunohistoquímica de manera más profunda y exhaustiva , optimizar el diseño de las técnicas y promover su desarrollo.
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Referencias