Prueba de PCR en tiempo real de fluorescencia de Listeria monocytogenes

salmonela

Detección in vitro por PCR fluorescente en tiempo real de Listeria monocytogenes.

Especificación: 96 T / caja
El kit se almacena a 2-8 ℃.
El período de validez es de 12 meses.
Especificación: 96 T / caja

Usos: Detección in vitro por PCR fluorescente en tiempo real de Listeria monocytogenes.

Principio de detección: El kit contiene cebadores específicos de Listeria monocytogenes. Cuando la muestra contiene Listeria monocytogenes, el ADN de Listeria monocytogenes extraído después del preenriquecimiento se amplifica exponencialmente mediante PCR. Durante la reacción, la sonda fluorescente específica de Listeria monocytogenes se hibrida con el ácido nucleico diana y es simultáneamente la enzima Taq Hidrólisis para separar el grupo fluorescente del grupo de extinción en la sonda: de modo que la presencia de Listeria monocytogenes se pueda juzgar en tiempo real por el incremento de fluorescencia.

Producto y composición:
Composición (96T / kit)EspecificacionesCantidad
Solución de extracción de ADN3ml1 tubo
Solución de reacción de PCR de Listeria monocytogenes1100ul1 tubo
Tap enzima (5U / ul)20ul1 tubo
Control positivo de Listeria monocytogenes40ul1 tubo
Control negativo de Listeria monocytogenes0.5ml1 tubo
Manual de instrucciones1
Condiciones de almacenamiento y fecha de caducidad del kit:
1. El kit se almacena a 2 - 8 ℃.
2. El período de validez es de 12 meses.

Instrumentos aplicables:
ABI7500, 9600 series, MJ opticon2, Bio-Rad y otros instrumentos de PCR cuantitativos fluorescentes están disponibles

Método experimental:
1. Tomar 1 ml de la solución de enriquecimiento en un tubo de centrífuga estéril de 1.5 ml, centrifugar a 1 rpm durante 10.000 min y desechar el sobrenadante; utilice el método clásico de extracción de fenol cloroformo para probar la plantilla extraída o almacénela a 5 ° C hasta que se pruebe.
2. Coloque la solución de reacción de PCR a temperatura ambiente para equilibrar, tome la enzima Taq después de la fusión y agregue la enzima Taq a 2∪ / tubo, es decir, cada sistema de reacción de prueba se prepara como: solución de reacción de PCR 22.5u1 + 0.4ulTaq enzima.
3. Añadir la plantilla: descongelar el extracto de ácido nucleico almacenado a -20 ° C a temperatura ambiente y centrifugar a 13,000 rpm durante 5 minutos. Los controles negativo y positivo se descongelan a temperatura ambiente antes de su uso. En cada tubo de reacción de PCR, agregue 2 ul de la plantilla o controles negativos y positivos procesados ​​en el paso 1, cubra el tubo, colóquelo en el instrumento de PCR y registre el número de muestra correspondiente.
4. Área de amplificación y detección a bordo: las condiciones de reacción son 95C: 3 min, 1 ciclo; 95C: 5 segundos, 60C: 40 segundos (adquisición de señal), 40 ciclos. El sistema de reacción se fijó en 25 µl.
Para el instrumento de PCR de fluorescencia multicanal, la señal se establece en Fam fluoresceína.

Juicio de resultados:
Consulte el manual para obtener más detalles.

Precauciones para el uso del kit:
1. Este kit solo se utiliza para pruebas in vitro y con fines de investigación. Lea atentamente el texto completo de este manual antes de empezar a utilizarlo.
2. El experimento debe dividirse estrictamente: área de preparación previa a la PCR: preparar reactivos experimentales; área de procesamiento de muestras: muestras para analizar, procesamiento de plantillas; área de detección-amplificación por PCR, detección.
3. Para conocer las normas de gestión de laboratorio pertinentes, consulte la implementación de las normas de gestión para laboratorios de amplificación de genes emitidas por las autoridades nacionales pertinentes.

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    Preguntas de trivia: Listeria monocytogenes

    Sobre la listeria

    Definición de listeria

    Listeria es una bacteria anaerobia facultativa que es el agente causante de la listeriosis. Listeria es una bacteria Gram-positiva que pertenece al filo de paredes gruesas, llamado así por Joseph Lister. Utiliza principalmente alimentos como vector y es uno de los patógenos transmitidos por los alimentos más letales.

    La listeria es omnipresente en el medio ambiente y se puede encontrar en la mayoría de los alimentos. Se ha demostrado que la carne, los huevos, las aves, los mariscos, los productos lácteos, las verduras, etc. son fuentes de infección por Listeria. La intoxicación por Listeria monocytogenes puede causar infecciones de la sangre y del tejido cerebral. Muchos países han tomado medidas para controlar Listeria monocytogenes en los alimentos y han establecido las normas correspondientes.

    Fuentes de Listeria

    Listeria fue descubierta por primera vez en 1926 por un científico británico de origen sudafricano Murray en un conejo enfermo. En conmemoración del padre de la cirugía de desinfección moderna, el fisiólogo británico Joseph Lister (1827-1912), en 1940, fue nombrada Listeria monocytogenes en el III Congreso Internacional de Microbiología.

    Especies de Listeria

    La Listeria monocytogenes reconocida internacionalmente tiene las siguientes siete cepas:
    Listeria monocytogenes, Listeria mutans, Listeria innocolus, Listeria welsii, Listeria sileeri, Listeria monocytogenes, Listeria monocytogenes. Entre ellos, L. monocytogenes es el único que puede causar enfermedades humanas. Es un patógeno de enfermedades zoonóticas. El envenenamiento grave puede provocar infecciones de la sangre y del tejido cerebral. Listeria monocytogenes se abrevia como Listeria monocytogenes, que es una bacteria Gram-positiva y pertenece al filo de paredes gruesas.

    Infección por listeria

    En el género Listeria, solo Listeria monocytogenes puede causar enfermedades como meningitis, sepsis, aborto espontáneo e infección neonatal en humanos. Si una persona con inmunodeficiencia desarrolla una infección por Listeria, la enfermedad es grave y la tasa de mortalidad llega hasta el 33%.

    Los síntomas de la listeria

    La infección por listeria puede ir acompañada de fiebre, dolor de cuello, vómitos o diarrea. Las formas más complejas también pueden causar encefalitis y formas específicas de meningitis. Las mujeres embarazadas también corren el riesgo de contraer Listeria. Las mujeres embarazadas tienen 20 veces más probabilidades de infectarse con Listeria que otras. Incluso si no hay un aborto espontáneo o un mortinato, el recién nacido puede tener esta enfermedad infecciosa desde el nacimiento, por lo que existe una tasa de mortalidad muy alta.

    Listeria monocytogenes

    ¿Qué son la listeria monocytogenes?

    Listeria monocytogenes es un patógeno de enfermedades zoonóticas. Puede causar listeriosis en humanos y animales. Después de la infección, se manifiesta principalmente como sepsis, meningitis y células mononucleares. Debido a que la bacteria es un parásito intracelular, su eliminación por parte del huésped depende principalmente de la función inmunitaria celular. Por tanto, la listeriosis afecta principalmente a recién nacidos, ancianos y personas inmunodeprimidas. Listeria monocytogenes se infecta principalmente a través de las heces y también puede ingresar al cuerpo a través de los ojos y dañar la piel y las membranas mucosas para causar una infección.

    Distribución de Listeria monocytogenes

    Listeria monocytogenes existe ampliamente en la naturaleza, no es fácil de congelar y descongelar y puede tolerar una presión osmótica más alta. Las bacterias están presentes en el suelo, las aguas superficiales, las aguas residuales, las aguas residuales, las plantas, el ensilaje, las verduras podridas, por lo que los animales pueden ingerirlas fácilmente.

    La vía de transmisión de Listeria monocytogenes

    Listeria monocytogenes utiliza principalmente alimentos como agente infeccioso. Es uno de los patógenos transmitidos por los alimentos más mortales y provoca la muerte del 20 al 30% de las personas infectadas. La tasa de mortalidad es incluso más alta que la de Salmonella y Botox. La gente come principalmente queso blando, pollo subcalentado, perritos calientes sin calentar, leche fresca, leche pasteurizada, helado, bistec crudo, chuletas de cordero, ensalada de repollo, apio, tomates, pasteles franceses, lengua de cerdo congelada, etc. Aproximadamente el 80% -90% de los casos son causados ​​por alimentos contaminados.
    La bacteria puede ingresar al cuerpo a través de los ojos y dañar la piel y las membranas mucosas y causar una infección. Después de la infección, las mujeres embarazadas infectan al feto o al recién nacido a través de la placenta o el canal de parto. Las bacterias que habitan la vagina y el cuello uterino también pueden causar infecciones. El contacto sexual también es una posible vía de transmisión de la enfermedad y existe una tendencia ascendente.

    Enfermedad por Listeria monocytogenes

    Síntomas de Listeria monocytogenes

    El hecho de que Listeria monocytogenes se enferme después de ingresar al cuerpo humano está relacionado con la virulencia de las bacterias y la edad y el estado inmunológico del huésped, porque la bacteria es una bacteria parasitaria intracelular, y su eliminación por el huésped depende principalmente de la función inmunitaria celular. . Por tanto, las personas susceptibles son los recién nacidos, las mujeres embarazadas y los adultos mayores de 40 años. Además, los alcohólicos, las personas con sistemas inmunitarios dañados o defectuosos, los pacientes que reciben agentes inmunosupresores y corticosteroides y los trasplantes de órganos también son susceptibles a la infección por la bacteria. Las manifestaciones clínicas de la enfermedad, individuos adultos sanos tienen síntomas leves similares a los de la influenza, neonatos, mujeres embarazadas, pacientes con inmunodeficiencia con dificultad para respirar, vómitos, erupción hemorrágica, conjuntivitis supurativa, fiebre, convulsiones, coma, aborto espontáneo, meningitis, sepsis hasta muerte.

    Tratamiento de Listeria monocytogenes

    Se pueden usar penicilina, ampicilina, gentamicina, eritromicina, etc. para el tratamiento de la infección por Listeria monocytogenes. La eritromicina y otros antibióticos de amplio espectro son alérgicos a la penicilina.

    Prevención de Listeria monocytogenes

    Listeria monocytogenes puede sobrevivir al procesamiento térmico normal, el tratamiento térmico ha matado a la comunidad bacteriana competitiva, lo que hace que Listeria monocytogenes sea fácil de sobrevivir en ausencia de condiciones ambientales competitivas, por lo que en el procesamiento de alimentos, la temperatura central debe alcanzar los 70 ° C durante más de 2 minutos. La Listeria monocytogenes es de naturaleza generalizada, por lo que incluso si el producto se ha sobrecalentado y procesado, la Listeria monocytogenes se inactiva por completo, pero puede causar una contaminación secundaria del producto, por lo que después de la cocción, prevenir la contaminación secundaria es extremadamente importante. Debido a que Listeria monocytogenes aún puede crecer y reproducirse a 4 ° C, los alimentos refrigerados sin calentar aumentan el riesgo de intoxicación alimentaria, y los alimentos refrigerados deben calentarse antes de consumirlos.

    Prueba de Listeria monocytogenes

    1. Método de cultivo bacteriano

    El método de prueba tradicional para Listeria en los alimentos es realizar un enriquecimiento previo o un enriquecimiento selectivo, y utilizar las colonias sospechosas aisladas y cultivadas para experimentos de reacción bioquímica, experimentos de hemólisis y experimentos de hemólisis cooperativa (CAM P). Después de la serotipificación adicional de Listeria monocytogenes. El enriquecimiento y el enriquecimiento selectivo son pasos indispensables en este método. Los métodos de enriquecimiento incluyen principalmente: método de enriquecimiento en frío y método de cultivo a temperatura normal. El método de enriquecimiento en frío se cultiva a 4 ° C durante 30 días, a veces incluso hasta un año. A temperatura ambiente, las bacterias deben cultivarse durante 24 horas a 7 días. Por lo tanto, el método de detección tradicional requiere de 7 a 11 días para aislar e identificar Listeria monocytogenes, por lo que el período de detección del método tradicional es más largo.

    2. Aglutinación de suero

    Según los antígenos bacterianos y los antígenos flagelares, la ML se divide en 16 serotipos: 1 / 2a, 1 / 2b, 1 / 2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e, 5, 6a, 6b , 7. La estructura del antígeno no tiene nada que ver con la virulencia. Los principales factores patogénicos para los seres humanos son los serotipos 1 / 2a, 1 / 2b y 4b, que representan alrededor del 90% de los casos globales de esta enfermedad.

    3. Métodos de prueba de biología molecular

    3 .1 Tecnología de detección de sonda
    Esta tecnología es el organismo molecular más antiguo utilizado en la detección de Listeria.
    Aprenda tecnología. Ya en 1988, Atin et al. clonó y secuenció un fragmento de ADN de 500 pb del gen de la beta-hemolisina de Listeria y sintetizó cuatro sondas de oligonucleótidos a partir de esta secuencia, marcó la sonda con 32P y realizó un experimento de hibridación puntual Se confirmó que la sonda solo reaccionaba con Listeria monocytogenes, y fue negativo con otras especies de Listeria y bacterias ajenas al género, mostrando buena especificidad.

    3.2 Tecnología de detección de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
    El desarrollo de la PCR es bastante maduro y se usa ampliamente en la detección de Listeria. Los cebadores específicos de amplificación por PCR se diseñan en base a la secuencia del gen de virulencia específico de Listeria monocytogenes, y uno se diseña en base a la secuencia específica en el genoma de Listeria monocytogenes. Las secuencias diana comúnmente utilizadas son genes de virulencia tales como hly A, iap, inl, Dth-18. La ventaja de utilizar el método de PCR para detectar Listeria es la especificidad del método, pero la desventaja es la baja sensibilidad; el cultivo de la muestra se amplifica después de la extracción química, lo que mejora la tasa de detección de la muestra; y no se pudo detectar una Listeria monocytogenes "viva, no cultivable" mediante métodos de enriquecimiento tradicionales.

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