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inmunocromatografia

¿Cómo desarrollar una prueba rápida basada en inmunocromatografía?

Publicado el  11 de septiembre de 2020, Editado por Jason, Categoría  

Navegación Rápida
¿Qué es la inmunocromatografía?
El principio de la inmunocromatografía.
El método de ensayo común en inmunocromatografía.
Las partículas comúnmente coloreadas que se utilizan en inmunocromatografía.
¿Qué es el oro coloidal?
El método de ensayo de 3 tipos basado en inmunocromatografía con oro coloidal
Las materias primas utilizadas en el desarrollo de inmunocromatografía.
El equipo utilizado en el desarrollo de inmunocromatografía.
El procedimiento de fabricación en el desarrollo de inmunocromatografía.
¿Cómo utilizar la inmunocromatografía con oro coloidal para la detección de la seguridad alimentaria?
Conclusión

¿Qué es la inmunocromatografía?

Inmunocromatografía (ensayo de inmunocromatografía, ICA) es un nuevo tipo de método de inmunoensayo que apareció a principios de la década de 1980. Es un inmunoensayo sencillo y rápido establecido en base a la inmunofiltración (IFA).

El principio de la inmunocromatografía.

El principio de la inmunocromatografía es fijar un anticuerpo específico en una determinada zona del membrana de nitrocelulosa. Cuando el extremo seco de nitrocelulosa se sumerge en la muestra (analito), debido a la acción capilar, la muestra avanzará a lo largo de la membrana, al moverse hacia el área donde se fija el anticuerpo, el antígeno correspondiente en la muestra se une específicamente al anticuerpo. . Si se tiñe con inmunooro o inmunoenzima, el área puede mostrar una banda de color para lograr un inmunodiagnóstico específico.

El método de ensayo común en inmunocromatografía.

Radioinmunoensayo (RIA)

La tecnología RIA utiliza antígenos o anticuerpos marcados con isótopos radiactivos (como 125I, zhi32P, 3H, etc.) para medir la radiactividad de los rayos γ o rayos β con un detector de rayos γdao o un contador de centelleo líquido para determinar los anticuerpos o el volumen del antígeno. tecnología. Incluye radioinmunoensayo caracterizado por antígeno marcado y ensayo inmunorradiométrico (IRMA) caracterizado por anticuerpo marcado. El primero utiliza principalmente el método de unión competitiva en fase líquida, que mide tanto los antígenos macromoleculares como los antígenos de moléculas pequeñas; este último utiliza el método de fase sólida para medir los antígenos macromoleculares.

RIA ocupa una gran proporción en los primeros métodos de inmunoensayo de plaguicidas establecidos, y estableció la radiación de dieldrin, aldrin, 2,4-D y 2,4,5-T, paratión y paraquat. Inmunoensayo. Aunque este método es muy sensible (el RIA suele ser de 10 a 9 g, 10 a 12 g o incluso de 10 a 15 g) y tiene una amplia gama de aplicaciones, se requieren contadores costosos para realizar el RIA y también existen problemas como la radiación y la contaminación. . La aplicación y el desarrollo del campo de la detección están sujetos a ciertas restricciones y son reemplazados gradualmente por otros métodos de inmunoensayo.

Inmunoensayo enzimático (inmunoensayo enzimático, EIA)

EIA es una tecnología de inmunoensayo desarrollada después de RIA. El principio de detección es similar al del radioinmunoensayo, pero el marcador utilizado es una enzima, que combina orgánicamente la reacción inmune específica de antígenos y anticuerpos con la catálisis de enzimas de alta eficacia. Se mide la actividad de la enzima unida a la fase sólida para determinar la cantidad de sustancia. Las enzimas utilizadas como marcadores incluyen peroxidasa de rábano picante (HRP) y fosfatasa alcalina (AKP), glucosa oxidasa (GO), ureasa (ureasa), etc.

El soporte sólido para la reacción de etiquetado enzimático incluye membranas y tubos de plástico de poliestireno. En la actualidad, la mayoría de las placas de microtitulación de 96 pocillos (MTP) se utilizan como soporte sólido. Este tipo de placa tiene una gran capacidad de detección y una gran cantidad de muestras, y solo un simple lector de microplacas puede obtener datos de detección precisos. Algunos académicos también usan perlas magnéticas como materiales en fase sólida para la investigación de EIA. El principio es envolver materiales poliméricos (poliestireno, cloruro de polivinilo, etc.) en el exterior de pequeñas partículas metálicas (Fe2O3, Fe3O4) y luego unirse químicamente con grupos amino. (-NH2), carboxilo (-COOH), hidroxilo (-OH) y otros grupos activos se acoplan con anticuerpos o antígenos para formar perlas inmunes. Las ventajas de este método son que las microperlas tienen una gran superficie específica, una gran capacidad de adsorción y pueden suspenderse en la fase líquida para capturar rápida y uniformemente el analito en la muestra. Después de aplicar un campo magnético, las microperlas se pueden separar de la solución de muestra rápidamente, reduciendo así la detección. Tiempo, mejora la sensibilidad de detección.

Debido a que los reactivos marcados con enzimas son fáciles de preparar, estables y económicos, y la sensibilidad del inmunoensayo enzimático es cercana a la de la tecnología radioinmune, la tecnología EIA se ha desarrollado rápidamente en los últimos años y se han desarrollado una variedad de métodos EIA. Entre ellos, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, ELISA) es actualmente la técnica de inmunoensayo enzimático más utilizada en la detección de residuos de plaguicidas.

Inmunoensayo de fluorescencia (inmunoensayo de fluorescencia, FIA)

El principio básico de la detección de FIA ​​es combinar orgánicamente la alta especificidad de los antígenos y anticuerpos con la sensible capacidad de medición de la fluorescencia, y utilizar sustancias fluorescentes como trazadores para marcar anticuerpos, antígenos o moléculas de hapteno para preparar reactivos fluorescentes específicos de alta calidad. Cuando la sustancia fluorescente en el conjugado antígeno-anticuerpo se irradia con luz ultravioleta o luz azul, puede absorber energía luminosa y entrar en un estado excitado. Cuando vuelve al estado fundamental desde el estado excitado, puede emitir la energía luminosa absorbida en forma de radiación electromagnética, lo que produce fluorescencia. Trazar la curva de concentración de plaguicida-intensidad de fluorescencia puede detectar cualitativa y cuantitativamente residuos de plaguicidas en las muestras.

La fluoresceína adecuada para el marcaje de anticuerpos, antígenos o moléculas de hapteno debe cumplir los requisitos:

  1. Debe tener un grupo químico que pueda formar un enlace covalente estable con la molécula de proteína, o transformarse fácilmente en este tipo de reacción sin destruir su estructura fluorescente;
  2. Después del etiquetado, la estructura química y las propiedades de la fluoresceína y el anticuerpo o antígeno no cambiarán;
  3. La eficacia de la fluorescencia es alta y el requisito de unión con la proteína es pequeño;
  4. El proceso de unión de la fluoresceína a la proteína es sencillo y rápido, y la fluoresceína libre y sus productos de degradación se eliminan fácilmente;
  5. El conjugado tiene un rendimiento estable en condiciones generales de almacenamiento y se puede almacenar durante mucho tiempo.

Inmunoensayo de quimioluminiscencia (inmunoensayo luminiscente, LCIA)

LCIA se puede dividir en inmunoensayo quimioluminiscente (inmunoensayo quimioluminiscente, CLCIA) e inmunoensayo bioluminiscente (inmunoensayo bioluminiscente, BLCIA).

En 1976, Shroeder estableció por primera vez una tecnología de inmunoensayo de quimioluminiscencia homogénea utilizando el sistema de biotina (B) -avidina (A). Posteriormente, Halman y Velan lo extendieron a sistemas heterogéneos, que ahora se han infiltrado en la investigación biológica. Varios campos. El principio es indicar la combinación de antígeno y anticuerpo por luminiscencia. Cuando el marcador luminiscente se combina con el anticuerpo o antígeno correspondiente, el sustrato reacciona con la enzima, o reacción redox con el agente luminiscente, o la sustancia fluorescente (como rubrene, etc.) excita y libera energía luminosa. Finalmente, se midió la intensidad luminosa con un fotómetro para análisis cuantitativo. Los marcadores luminiscentes de uso común son peroxidasa de rábano picante (HRP), luminol (luminol), isoluminol (isoluminol), lofina (lofina), lucigen (lucigen), doble (2, 4, 6) -triclorobenceno) oxalato, bifeniltriol y 6 [N- (4-diaminobutil) -N-etil] -amino-2,3-dihidrofenazina-1,4-diona (ABEI), etc. Cuando el anticuerpo (o antígeno) marcado con el marcador luminiscente mencionado anteriormente se combina con el antígeno correspondiente (o anticuerpo) en una determinada solución tampón de pH, emitirá luz bajo la acción de un factor cooperante (como H2O2, etc.), y su intensidad luminosa será la misma que la de la sustancia de ensayo. Es proporcional a la concentración, por lo que se puede utilizar para análisis cuantitativos.

El inmunoensayo de luminiscencia tiene las ventajas de una fuerte especificidad, alta sensibilidad (límite de detección de 10-15 mol / L), rápida (1 ~ 3h) y fácil disponibilidad de materiales luminiscentes. Sin embargo, su proceso e intensidad de luminiscencia a menudo se ven afectados por la estructura química de la sustancia luminiscente en sí, el pH del medio, la sustancia columiniscente y las impurezas de iones metálicos.

Ensayo de inmunocromatografía de oro (ensayo de inmunocromatografía de oro, GICA)

El principio de detección de GICA es recubrir los ligandos (anticuerpos o antígenos) en una membrana microporosa como membranas de nitrocelulosa en forma lineal. La etiqueta de oro coloidal también se fija con ligandos u otras sustancias en estado seco sobre el material absorbente. La acción capilar hace que la solución de muestra nade sobre la tira cromatográfica. Cuando nada hacia el marcador de oro coloidal, si la muestra contiene el receptor que se va a analizar, el primer paso es una respuesta inmune altamente específica para formar un complejo inmune. se produce una respuesta inmune específica, y el complejo inmune formado queda atrapado en el área lineal recubierta, y la banda roja se muestra con el oro coloidal marcado (banda de detección), mientras que la etiqueta libre cruza la banda de detección y se separa automáticamente de la etiqueta unida . La determinación cualitativa o cuantitativa se puede lograr detectando la presencia o ausencia de color o el tono del color en el cinturón2.

Detección del kit de prueba de oro coloidal

El método GICA tiene las ventajas de resultados rápidos (5-20 min), económicos y claros, sin habilidades operativas complicadas y equipos especiales, y fácil de transportar. Sin embargo, en comparación con otros métodos de inmunoensayo, la sensibilidad de detección de este método es ligeramente menor y es principalmente adecuado para la determinación rápida cualitativa o semicuantitativa in situ. En la actualidad, este método se ha utilizado en muchos campos de investigación como la medicina y la biología, y se ha utilizado ampliamente, especialmente en los países desarrollados.

Tecnología combinada de inmunoensayo y tecnología de análisis instrumental.

El uso de una sola técnica de IA para analizar residuos de plaguicidas tiene menos información y la selectividad de los métodos de análisis físico y químico es relativamente pobre. Kramer y col. utilizó inmunoensayos y cromatografía líquida (CL) en combinación, simplificando así el método de análisis y mejorando la eficiencia de detección. La combinación de LC-IA combina la alta capacidad de separación de LC con la alta sensibilidad y alta especificidad de IA. Este método de análisis es especialmente adecuado para microanálisis y análisis de residuos de varios componentes. La combinación de inmunoensayo y cromatografía de gases o espectrometría de masas (GC o MS) puede reducir las reacciones cruzadas en el análisis de pesticidas o metabolitos con estructuras similares para reducir los falsos positivos.

Las partículas comúnmente coloreadas que se utilizan en inmunocromatografía.

Nanopartícula de oro coloidal
Partícula de látex
Partícula de carbono
Perlas magnéticas
Tintes fluorescentes
Puntos cuánticos
Conversión ascendente luminiscente

¿Qué es el oro coloidal?

partícula de oro coloidal
partícula de oro coloidal

Oro coloidal, también conocida como nanopartículas de oro, es una suspensión estable, uniforme y de dispersión única de partículas de oro suspendidas en un líquido después de que la sal de oro se reduce a oro. Las partículas de oro están compuestas por un átomo de oro y una capa de iones dobles que lo rodea.

El color de la solución depende del color del material de la fase dispersa, la dispersión del material de la fase dispersa y el tipo de luz incidente, ya sea luz dispersa o luz transmitida. Cuanto más pequeñas son las partículas y más alta la dispersión, más corta es la longitud de onda de la luz dispersa. Para el hidrosol de la misma sustancia, el tamaño de partícula es diferente y el color también es diferente.

Por ejemplo, el tamaño de las partículas de oro coloidal entre 5-20 nm, la longitud de onda de absorción de 520 nm, son de color vino tinto; el tamaño entre 20-40 nm absorbe principalmente la luz verde con una longitud de onda de 530 nm, y la solución es de color rojo oscuro; la partícula de oro coloidal de 60 nm absorbe principalmente la luz naranja de 600 nm de longitud de onda, la solución es azul violeta. Las partículas de oro coloidal generalmente utilizadas en inmunohistoquímica están en el rango de 5-60 nm y la solución aparece roja.

El método de ensayo de 3 tipos basado en inmunocromatografía con oro coloidal

La partícula de color más popular es la nanopartícula de oro. Tecnología de oro coloidal que combina la respuesta inmune antígeno-anticuerpo y la tecnología de etiquetado de oro coloidal para la detección cualitativa y cuantitativa del contenido de antígeno y anticuerpo. Debido a sus ventajas tales como rapidez, simplicidad, bajo costo y buena estabilidad, la detección de oro coloidal se ha utilizado ampliamente en el campo de la detección clínica.

En la actualidad, los métodos de detección comúnmente utilizados de las plataformas de detección de oro coloidal incluyen el método sándwich de doble anticuerpo, el método de competencia y el método indirecto. Existen grandes diferencias entre el método de ensayo y los analitos.

Método sándwich de doble anticuerpo

El método sándwich de doble anticuerpo es el método de detección más utilizado para las plataformas de detección de oro coloidal, que se utiliza principalmente para detectar biomoléculas relativamente grandes y antígenos particulados. El método sándwich de doble anticuerpo requiere la preparación del anticuerpo emparejado del antígeno que se va a analizar. Un anticuerpo se marca con oro coloidal y se fija en la almohadilla de conjugado, y el otro anticuerpo se fija en la línea de detección (línea T) de la membrana NC. Además, es necesario preparar un anticuerpo secundario que se una específicamente al anticuerpo marcado con oro (es decir, anticuerpo marcado con oro coloidal) y fijarlo en la línea de control (línea C) de la membrana NC.

inmunoensayo de flujo lateral
inmunoensayo de flujo lateral
banda de flujo lateral

Cuando la muestra se haya agregado a la tira, se moverá a la almohadilla de muestra, almohadilla conjugada, línea T, línea C y almohadilla absorbente (almohadilla absorbente) en secuencia a través del principio de flujo capilar. La reacción de cada etapa se muestra en la siguiente tabla:

Ejemplo de pad conjugado move TMovimiento de muestra a la línea TMover la muestra a la línea CResultado
Anaylte contiene antígenoAntígeno capturado con anticuerpo marcado con oro, convertido en un complejoEl anticuerpo de la línea T fijada capturará el complejo y la banda de color será visibleEl anticuerpo secundario capturará el anticuerpo marcado con oro y la banda de color visibleDos líneas visibles
Anaylte sin antígenoSin reacciónSin cambio de colorIgual arribaSolo la línea C visible

Por lo tanto, cuando se muestran dos líneas rojas en la tira, significa que la sustancia a analizar en la muestra es positiva; cuando solo hay una línea C en la tira, significa que la sustancia a analizar en la muestra es negativa. La alta concentración de la sustancia tendrá una banda de color más fuerte en la línea T.

Método de competición

Los antígenos de molécula pequeña son difíciles de preparar anticuerpos emparejados (peso molecular demasiado pequeño, es difícil encontrar dos sitios de unión para que dos anticuerpos se unan al mismo tiempo), por lo que los antígenos de molécula pequeña no pueden detectarse mediante el método sándwich de doble anticuerpo. Para antígenos de molécula pequeña, generalmente se usa el método de competencia para el ensayo.

En el método de competición, el anticuerpo marcado con oro se fija en la almohadilla cojugada o, y la línea T en la membrana NC se fija con el antígeno acoplado macromolecular que se va a analizar (los antígenos de molécula pequeña no pueden fijarse directamente en la membrana NC. Por lo tanto, , es necesario acoplar químicamente moléculas pequeñas a BSA y otras sustancias macromoleculares y luego inmovilizarlas en la membrana NC). El segundo anticuerpo que puede unirse específicamente al anticuerpo marcado con oro se inmoviliza en la línea C.

desarrollo-ensayo-de-flujo-lateral
desarrollo-ensayo-de-flujo-lateral
dispositivo de flujo lateral
dispositivo de flujo lateral

Cuando la muestra se haya agregado a la tira, se moverá a la almohadilla de muestra, almohadilla conjugada, línea T, línea C y almohadilla absorbente (almohadilla absorbente) en secuencia a través del principio de flujo capilar. La reacción de cada etapa se muestra en la siguiente tabla:

Ejemplo de pad conjugado move TMovimiento de muestra a la línea TMover la muestra a la línea CResultado
Anaylte contiene antígenoAntígeno capturado con anticuerpo marcado con oro, convertido en un complejoNo se puede capturar ningún antígeno. Sin banda de colorEl anticuerpo secundario capturará el anticuerpo marcado con oro y la banda de color visibleSolo la línea C visible
Anaylte sin antígenoSin reacciónCapture el anticuerpo marcado con oro y la banda de color visibleIgual arribaDos líneas visibles

Por lo tanto, cuando se muestran dos líneas rojas en la tira, significa que la sustancia a analizar en la muestra es negativa; cuando solo hay una línea C en la tira, significa que la sustancia a analizar en la muestra es positiva. La alta concentración de la sustancia tendrá una banda de color más fuerte en la línea T.

Método indirecto

El método indirecto se utiliza principalmente para detectar anticuerpos. Si es un método indirecto, la almohadilla de conjugado se fija con proteína A marcada con oro coloidal (la proteína A puede unirse al anticuerpo de manera no específica). La línea T en la membrana NC se fija con un antígeno que puede unirse específicamente al anticuerpo que se va a probar, y la línea C en la membrana NC se fija con un anticuerpo anti-Proteína A.

prueba inmunocromatográfica
prueba inmunocromatográfica
banda de flujo lateral

Cuando la muestra se haya agregado a la tira, se moverá a la almohadilla de muestra, almohadilla conjugada, línea T, línea C y almohadilla absorbente (almohadilla absorbente) en secuencia a través del principio de flujo capilar. La reacción de cada etapa se muestra en la siguiente tabla:

Ejemplo de pad conjugado move TMovimiento de muestra a la línea TMover la muestra a la línea CResultado
Anaylte contiene anticuerposAnticuerpo capturado con Proteína A marcado con oro, convertido en un complejoAnticuerpo de captura de antígeno, banda de color visibleProteína A capturada por el anticuerpo anti-proten A y banda de color visibleDos líneas visibles
Anaylte sin anticuerpoSin reacciónEl antígeno no puede capturar el antígeno, el color no cambiaEl anticuerpo marcado con oro capturado por el anticuerpo secundario, banda de color visibleSolo la línea C visible

Por lo tanto, cuando se muestran dos líneas rojas en la tira, significa que la sustancia a analizar en la muestra es positiva; cuando solo hay una línea C en la tira, significa que la sustancia a analizar en la muestra es negativa. La alta concentración de la sustancia tendrá una banda de color más fuerte en la línea T.

Las materias primas utilizadas en el desarrollo de inmunocromatografía.

  1. Antígeno y anticuerpo
  2. Albúmina de suero bovino
  3. Flujo lateral de la tarjeta de respaldo
  4. Membrana de nitrocelulosa
  5. Almohadilla de muestra (Almohadilla absorbente)
  6. Almohadilla conjugada
  7. Almohadilla absorbente
  8. Membrana de separación de sangre (opcional)
  9. Caja de casete (opción)

El equipo utilizado en el desarrollo de inmunocromatografía.

  1. Sistema de dispensación robótico (Dispensador)
  2. Cortador de tiras para tira de ensayo de flujo lateral
  3. Micropipeta
  4. Secador por congelación al vacío
  5. Aspiradora horno
  6. Centrífuga refrigerada de alta velocidad
  7. Sistema de manejo de líquidos (opcional)
  8. Procesador de caja de casete (opcional)

El procedimiento de fabricación en el desarrollo de inmunocromatografía.

  1. Oro coloidal preparado
  2. Etiquetado de oro coloidal
  3. Dispensación de antígeno o anticuerpo a Membrana de nitrocelulosa
  4. Adhesivo de membrana de nitrocelulosa tarjeta de respaldo
  5. Almohadilla de conjugado laminada en la tarjeta de respaldo
  6. Almohadilla de muestra laminada en la tarjeta de respaldo
  7. Almohadilla absorbente laminada en la tarjeta de respaldo
  8. Pegue la etiqueta con el logotipo en la almohadilla absorbente (opcional)
  9. Cortando el hoja sin cortar en tiras
  10. Cargue las tiras en la bolsa o botella de aluminio
  11. Embalaje en caja

Más detalles, consulte Cómo desarrollar una prueba rápida de ensayo de flujo lateral?
Cómo automatizar el ensamblaje para una prueba rápida?

Cómo utilizar la inmunocromatografía con oro coloidal para inocuidad de los alimentos detección?

Inmunocromatografía de oro coloidal ampliamente utilizado en pruebas de alimentos durante muchos años. Por ejemplo, cmo el prueba de leche trabajar con los residuos de antibióticos en la leche cruda?

El antibiótico es una molécula pequeña, por lo que el ensayo elige el método de competencia. ¿Cuál es el mecanismo de reacción?

Veamos la estructura de la tira:

ensayo de flujo lateral
ensayo de flujo lateral
nanopartículas de oro
nanopartículas de oro

El anticuerpo marcado con oro coloidal liofilizado en platos de pozo. Separación de la tira, aumenta el tiempo de incubación y mejora la sensibilidad de detección.

Mecanismo de reacción de flujo lateral

tecnología de flujo lateral
tecnología de flujo lateral
inmunocromatografia
inmunocromatografia

En muestra positiva:

  1. Tomar una muestra de leche cruda y agregarla a los micropozos.
  2. Si la leche cruda contiene moléculas pequeñas, como betalactámicos, tetraciclina, cloranfenicol, sulfonamidas, cefalosporinas, melamina, etc ....
  3. El anticuerpo marcado con oro (Au-Ab) en los micropocillos capturará las moléculas pequeñas de las muestras de leche y se convertirá en un nuevo complejo (Au-Ab unido a una molécula pequeña).
  4. Mientras que el complejo se mueve a la posición de la línea T, no hay posición para que el antígeno BSA (el antígeno que se fijó en T lin) se conjugue, porque la nanopartícula de oro ya está conjugada con moléculas pequeñas, por lo que la banda de color no cambiará.
  5. El anticuerpo secundario que se fijó en la línea C capturará el anticuerpo marcado con oro y la banda de color visible.
  6. El resultado será positivo.

En muestra negativa:

  1. El anticuerpo marcado con oro (Au-Ab) no puede capturar moléculas pequeñas de la leche cruda, pero será capturado por el antígeno de la línea T, luego la banda de color será visible.
  2. El anticuerpo secundario de la línea C todavía captura el anticuerpo marcado con oro (Au-Ab), banda de color visible.

La interpretación

El método colorimétrico para la interpretación de la prueba de la leche. La línea de prueba se compara con la línea de control para determinar un resultado positivo o negativo. Durante la fabricación para controlar la cantidad de Au-Ab para lograr un ensayo colorimétrico.

Conclusión

Inmunocromatografía es una tecnología de ensayo muy popular, ampliamente utilizada en productos de diagnóstico in vitro, no solo utilizada en pruebas de alimentos. Especialmente en el ensayo de flujo lateral, el ensayo de inmunocromatografía de oro coloidal no necesita equipo costoso, fácil de usar, costo más barato para ayudar al ser humano a vivir mejor, por ejemplo, prueba de embarazo en el hogar.

Referencia:

Cómo empezar a fabricar el kit de prueba Covid 19

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