Principio de PCR en tiempo real
Estructura de Aetamiprid
La PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real es un método para medir la cantidad total de productos después de cada ciclo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando productos químicos fluorescentes en una reacción de amplificación de ADN. Método para el análisis cuantitativo de secuencias de ADN específicas en una muestra que se analizará mediante métodos de referencia internos o externos.
La PCR en tiempo real es la detección en tiempo real del proceso de PCR a través de la señal fluorescente durante el proceso de amplificación por PCR. Debido a la relación lineal entre el valor Ct de la plantilla y el número de copias inicial de la plantilla durante el período exponencial de amplificación por PCR, se convierte en la base para la cuantificación.
El principio básico de la tecnología de la PCR es similar al proceso de replicación natural del ADN y su especificidad depende de cebadores oligonucleotídicos complementarios a ambos extremos de la secuencia diana.
Reactivos de PCR
Kit de PCR que incluye molde de ácido nucleico purificado, desoxirribonucleótido (dNTP), cebadores de oligonucleótidos y ADN polimerasa. La purificación de ácidos nucleicos y la evaluación de la calidad son pasos importantes en el proceso del experimento de PCR. Es importante utilizar técnicas adecuadas para aislar y purificar los ácidos nucleicos de las materias primas, ya que este paso afectará la reacción de amplificación.
La ADN polimerasa cataliza la adición de dNTP a las cadenas de ADN extendidas mediante la adición de bases que son complementarias a la cadena molde. La identificación de las ADN polimerasas termoestables y las modificaciones posteriores de estas enzimas desempeñan un papel clave en el desarrollo y la adopción generalizada de la reacción de PCR.
Reacción de PCR
Cinco elementos de la reacción de PCR: Hay cinco tipos de sustancias que participan en la reacción de PCR: cebadores (los cebadores de PCR son fragmentos de ADN y los cebadores para la replicación del ADN en la célula son una cadena de ARN), enzimas, dNTP, moldes y tampones ( de los cuales se requiere Mg2 +).
Pasos de PCR
El proceso de PCR estándar se divide en tres pasos:
Desnaturalización del ADN: (90 ℃ -96 ℃): Plantilla de ADN bicatenario bajo la acción del calor, el enlace de hidrógeno se rompe para formar ADN monocatenario.
Recocido: (60 ℃ -65 ℃): la temperatura del sistema se reduce y los cebadores se combinan con la plantilla de ADN para formar una doble hebra local.
Extensión: (70 ℃ -75 ℃): Bajo la acción de la enzima Taq (aproximadamente 72 ℃, la mejor actividad), el dNTP se utiliza como materia prima, comenzando desde el extremo 3 ′ del cebador y extendiéndose desde el 5 ′ → 3 ′ final. Sintetizar cadenas de ADN complementarias a la plantilla.
Cada ciclo sufre desnaturalización, hibridación y extensión, y el contenido de ADN se duplica. Ahora, algunas PCR tienen una región de amplificación corta, e incluso si la actividad de la enzima Taq no es óptima, se pueden replicar en un corto período de tiempo, por lo que se puede cambiar a un método de dos pasos, es decir, la hibridación y la extensión son realizado a 60 ℃ -65 ℃ al mismo tiempo. Para reducir el proceso de subida y bajada de temperatura, se aumenta la velocidad de reacción.
Resultados de PCR y análisis de PCR
1. Si hay una curva estándar bai, calcule de acuerdo con la curva estándar. du
2. Generalmente, la cantidad relativa se calcula mediante el método delta delta CT.
3. Los ejemplos son los siguientes: el valor CT del gen A en el grupo dao de control es 20, y el valor CT del control interno (como βactina) es 15. El valor CT del gen A en el grupo experimental fue 18, y el valor de CT de referencia interna fue 14.
4. Calcule primero el volumen de la muestra: delta CT = 15-14 = 1. La potencia de 2 es 2. En otras palabras, el volumen de muestra del grupo experimental es el doble que el del grupo de control. Gen A: delta CT = 20-18 = 2. La potencia de 2 es 4. En otras palabras, la cantidad de gen A en el grupo experimental fue 4 veces mayor que la del grupo de control. Sin embargo, debido a que la cantidad de muestra agregada es dos veces, entonces 4 = 2 = 2, la cantidad relativa final es 2 veces.
5. Algunos puntos: Debe determinarse la especificidad de la amplificación. Solo se puede restar el valor de CT del mismo objetivo (la eficiencia de amplificación puede ser diferente). La potencia de 2 es solo el valor teórico y la eficiencia de amplificación real es inferior a 2. Syber Green.
Aplicaciones de PCR
La PCR se suele aplicar a los siguientes aspectos:
1. Investigación básica sobre ácidos nucleicos: clonación del genoma
2. PCR asimétrica para preparar ADN monocatenario para la secuenciación del ADN
3. PCR inversa para determinar regiones de ADN desconocidas
4. La transcripción inversa daoPCR (RT-PCR) se utiliza para detectar el nivel de expresión génica en las células, la cantidad de virus ARN y clonar directamente el ADNc de genes específicos.
5. La PCR cuantitativa de fluorescencia se utiliza para el seguimiento en tiempo real de los productos de la PCR.
6. Amplificación rápida de extremos de cDNA
7. Detección de expresión genética
8. Aplicaciones médicas: detección de enfermedades bacterianas y virales; diagnosticar enfermedades genéticas; diagnosticar tumores; aplicando a la medicina forense.
Máquina de PCR
La máquina de PCR también se llama amplificador de genes de PCR, amplificador de ácido nucleico de PCR, amplificador de ácido nucleico de reacción en cadena de la polimerasa, es un tipo de instrumento y equipo que utiliza la tecnología PCR (reacción en cadena de la polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa) para amplificar ADN específico Es ampliamente utilizado en laboratorios médicos y biológicos, por ejemplo, para determinar si la muestra mostrará un mapa de enfermedades genéticas, diagnóstico de enfermedades infecciosas, replicación de genes y pruebas de paternidad.
PCR incluido
Las principales empresas perfiladas en el mercado de PCR de diagnóstico global son: Abbott Laboratories,
Agilent Technologies Inc.,
Alere Inc., Asuragen Inc.,
Biocartis Group Nv, Biofire Diagnostics LLC. (Adquirido por Biomerieux),
Biomérieux Sa,
Laboratorios Bio-Rad Inc.,
Cefeida (una empresa Danaher),
Genmark Diagnóstico Inc.,
Hologic Inc., Corporación Luminex,
meridiano biociencia inc.,
Qiagen NV,
Grupo Quantumdx,
Rock,
Biociencia espartana,
T2 Biosistemas
