Ažuriranje koronavirusa: postoji ukupno 3.66 miliona (podaci iz svjetski mjerač korona) zaražene osobe i potvrda slučaj koronavirusa u svetu. To će se iz dana u dan povećavati, smrtnih slučajeva brojevi koronavirusa 257,301. Komplet za otkrivanje je veoma važan za svaku zemlju radi poboljšanja i brzog pregleda sumnjivog slučaja. Popularna metoda detekcije je test nukleinske kiseline, drugi je test na antitijela covid 19, najnoviji test za otkrivanje antigena covid 19. Koje su različite 3 vrste testirati koronavirus?? Kako rade i princip testiranja? Ovaj članak će vam reći šta vas brine.
Danas je Nacionalna uprava za medicinske proizvode (NMPA) odobrila više od 113 vrsta novih hitnih medicinskih uređaja za koronavirus od 113 kompanija koje imaju CE oznaku ili odobrenje FDA. Od toga 80 vrsta za detekciju nukleinskih kiselina i 33 vrste za test na antitijela covid 19. Otkrivanje nukleinskih kiselina i antitijela u serumu (ili antigena) glavne su metode i postupci ispitivanja nove potvrde koronavirusa i dijagnoze pacijenta. Koji su uzorci potrebni i postupak rada? I sa kakvim se problemima sada suočavamo?
Detekcija nukleinske kiseline ima karakteristike rane dijagnostike, visoku osjetljivost i specifičnost. To je također "zlatni standard" za dijagnozu nove upale pluća zaražene koronavirusom. Najraširenija metoda je lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu (RT-PCR). Općenito, pozitivan rezultat SARS-CoV-2 zasniva se na istim uzorcima koji su na genima ORF1ab i N i zadovoljavaju pozitivne rezultate dvostruke mete, ili pozitivnu pojedinačnu metu ponovljenom detekcijom, ili oba uzorka ispunjavaju jednu metu istovremeno.
Gen virusa kao meta detekcije dopušta da se odabrana ciljna DNK sekvenca eksponencijalno povećava PCR amplifikacijskim kanalom. Svaka amplificirana DNK sekvenca može se kombinirati s fluorescentnom sondom koju smo dodali unaprijed. Što je više ciljnih gena pojačano, jača je akumulirana fluorescentna boja. U uzorcima bez virusa nema pojačanja ciljnog gena, pa se ne može otkriti jači signal fluorescencije. Stoga je detekcija nukleinske kiseline zapravo određivanje nukleinske kiseline u uzorku nakupljanjem fluorescentnih signala.
Uzorci su općenito brisevi iz nosa, brisevi ždrijela, nazofaringealni brisevi, sputum, tekućina za ispiranje bronhija, alveolarna tekućina za ispiranje (BALF) itd.
Postoji pet koraka: uzorkovanje, zadržavanje uzoraka, skladištenje, ekstrakcija nukleinske kiseline i računarsko testiranje. Svi ovi postupci zahtijevaju rigorozne naučne eksperimente:
1. Uzorkovanje. Obrišite stražnji zid ždrijela i obostrane ždrijelne krajnike brisom ždrijela 5-10 puta i stalno rotirajte bris
2. Zadržavanje uzorka. Uronite glavu brisa u rastvor za očuvanje ćelija, zatim slomite kraj brisa i odmah zategnite poklopac epruvete kao retenciju uzorka.
3. Skladištenje. Epruvetu za uzorak stavite u zapečaćenu vrećicu i na vrijeme je pošaljite na pregled. Prilikom prijelaza na inspekciju osigurajte okruženje za skladištenje na 2-8 stepeni ℃.
4. Ekstrakcija nukleinske kiseline. Ekstrahirajte nukleinsku kiselinu iz uzorka inaktiviranog virusa radi naknadne detekcije, možete koristiti automatiziranu opremu, poput instrumenta za ekstrakciju nukleinske kiseline.
5. Za otkrivanje nukleinske kiseline pomoću fluorescentne PCR, odnosno testiranje na mašini, potrošit će se 70-80 minuta da se završi PCR reakcija.
Stoga, dodavanje IgM i IgG antitijela kada je test nukleinske kiseline negativan, može nadoknaditi nedostatke propuštene dijagnoze.
Nakon 7 dana od infekcije koronavirusnom upalom pluća, postepeno se stvaraju serumska specifična antitijela, najprije imunoglobulinska (IgM) antitijela, a zatim IgG antitijela. Stoga, IgM antitijela ukazuju na nedavnu akutnu infekciju, a povećanje IgG antitijela ukazuje na istoriju infekcije.
Serumsko testiranje je uređeno u Program dijagnostike i liječenja COVID-19 (7th Probna verzija), jer ima najveću prednost brzog i praktičnog testiranja koje može probiti postojeće ograničenje ličnog i mjesta i skratiti vrijeme testiranja. Može se dijagnosticirati kao infekcija COVID-19 ako se sumnja da su pozitivna na serumska specifična antitijela IgM i IgG, ili ako se protutijelo IgG promijeni iz negativnog u pozitivno, ili je razdoblje oporavka 4 puta ili duže od onog u akutnom razdoblju.
Ovaj testni komplet je zasnovan na imunohromatografija koloidnog zlata test, koloidni rekombinantni roman označen zlatom korona virusa antigen i zlatni marker antitijela za kontrolu kvalitete prskaju se na vezni jastučić; dvije detekcijske linije (G i M) i jedna linija kontrole kvalitete (linija C) premazane su na NC membranu. Ova kartica za testiranje vodi tekući uzorak duž nitrocelulozne membrane, ako postoje IgM antitijela na COVID-19, antitijela će se spojiti s označenim antigenima virusa i postati sendvič konjugat, može se očitati pozitivan rezultat. A ako u uzorku ima IgG antitijela na COVID-19, antitijela će se spojiti s označenim antigenima virusa i postati sendvič konjugiran, a zatim će se pozitivan rezultat pojaviti na isti način. Testna kartica također ima liniju za kontrolu kvalitete (linija C) za procjenu uspješnosti procesa hromatografije.
Uzorci su općenito krv, uključujući serum, plazmu ili cijelu krv.
1. Otvorite vrećicu od aluminijske folije, izvadite testnu karticu i postavite je vodoravno na radnu površinu;
2. Pipetom izvucite uzorak seruma / plazme / cijele krvi i dodajte ga u udubinu za uzorak, a zatim uvucite otopinu pufera u udubljenje za uzorak.
3. Pričekajte 15 minuta, a zatim pročitajte rezultate.
1. Lažno pozitivan rezultat. Neki uzorci krvi pacijenata imaju reumatoidni faktor, heterofilna antitijela, autoantitijela, lijekove i tumorske stanice itd., Koji lako uzrokuju unakrsne reakcije u testu, a zatim će povremeno biti lažno pozitivnih rezultata.
2. Lažno negativan rezultat. Period prozora metode ispitivanja serumskih antitijela i različita osjetljivost kompleta za testiranje također će uzrokovati lažno negativan rezultat.
Stoga se otkrivanje antitijela u serumu koristi samo kao dodatni test za sumnjive slučajeve negativnog testa na nukleinsku kiselinu na COVID-19, i ne može se primijeniti kao dijagnostički pokazatelj samo za skrining. Kombinirana upotreba detekcije antitijela u serumu i detekcije nukleinske kiseline može pomoći poboljšati otkrivenu stopu COVID-19, otkriti što je više moguće dijagnosticiranih pacijenata i biti pogodnija za kontrolu epidemije.
Detekcija antigena COVID-19 može izravno otkriti sadrži li ljudski uzorak novi koronavirus. Dijagnoza je brza, precizna i zahtijeva malo opreme i osoblja. Sandwich ELISA dozvoljava dva antigen-specifična antitijela da se identificiraju i vežu za jednu metu kroz različite epitope, što može uvelike smanjiti unakrsnu reakciju i poboljšati specifičnost testa.
Antigeni poput proteina N, proteina E i proteina S novog koronavirusa mogu se koristiti kao imunogeni za stimulaciju plazma ćelija da proizvode specifična antitijela nakon što virus zarazi ljudsko tijelo. Prema principu sendvič ELISA -e, kada uzorak padne na jastučić za uzorak, on će teći kroz konjugacijsku podlogu, ispitnu liniju (T) i liniju za kontrolu kvalitete (C) na NC membrani.
Jastučić za konjugaciju sadrži označeno antigen-specifično antitijelo, koje se može vezati za antigen (virusni protein) u uzorku. Kad uzorak dosegne ispitnu liniju (T linija), drugo antigen-specifično antitijelo fiksirano na ovoj liniji će se ponovno kombinirati s antigenom, pozitivan rezultat će se očitati. Linija za kontrolu kvalitete (linija C) obložena je IgG antitijelom i može se kombinirati s antitijelom u jastučiću za uzorke kako bi se procijenilo je li proces hromatografije uspješan.
Uzorci su općenito s mjesta infekcije, poput brisa iz orofarinksa, brisa iz nazofarinksa, sputuma, seruma, plazme itd.
1. Ispustite obradu uzorka u epruvetu za uzorak;
2. Promiješajte bris za uzorkovanje i stisnite ga uz stijenku cijevi, tako da se uzorak potpuno pomiješa s otopinom za tretiranje;
3. Pripremite ispitnu karticu i dodajte uzorak u udubljenje za uzorke;
4. Pričekajte 15 minuta, a zatim pročitajte rezultate.
1. Lažno negativan. Detekcija antigena zahtijeva veću osjetljivost, jer novi koronavirus uvijek inficira donje dišne puteve, poput alveola. Ako prikupite uzorak gornji respiratorni trakt, poput nazofarinksa i orofarinksa, možda neće moći dobiti patogene ili dovoljno Covid-19 virus i uzrokovati propuštenu dijagnozu;
2. Proces pripreme je težak i dugotrajan. Za pripremu rekombinantnog antigena potrebno je oko dva ili tri mjeseca, a zatim za pripremu monoklonalnog antitijela kod miševa. Ako pripremljeno antitijelo ima slabe performanse, potrebno ga je ponovno pripremiti dva ili tri mjeseca.
Stoga metoda otkrivanja antigena još nije zrela, a Nacionalna uprava za medicinske proizvode trenutno nije odobrila i registrirala komplet za otkrivanje antigena
Nova detekcija nukleinske kiseline / antitijela / antigena koronavirusa ima svoje točke i ne mogu se međusobno zamijeniti. Različite metode detekcije mogu se primijeniti zajedno kao komplement, koje može kombinirati molekularnu biologiju s imunološkom detekcijom, dajući u potpunosti njihove prednosti, poboljšavajući osjetljivost i specifičnost. Sve ovo može efikasno skratiti period prozora za otkrivanje, povećati pozitivnu stopu detekcije i pružiti dvostruku zaštitu za sve moguće rizične grupe.
Referenca:
Zhengtu Li, Yongxiang Yi i dr. Razvoj i klinička primjena brzog testa protutijela na IgM -IgG za dijagnozu infekcije SARS -CoV -2. J Med Virol.2020 ； 1-7