Princip PCR -a u stvarnom vremenu
Struktura aetamiprida
Kvantitativna PCR fluorescencije u stvarnom vremenu je metoda za mjerenje ukupne količine proizvoda nakon svakog ciklusa lančane reakcije polimeraze (PCR) pomoću fluorescentnih kemikalija u reakciji amplifikacije DNA. Metoda za kvantitativnu analizu specifičnih DNK sekvenci u uzorku koja se testira internim ili eksternim referentnim metodama.
PCR u stvarnom vremenu je detekcija PCR procesa u stvarnom vremenu putem fluorescentnog signala tokom procesa amplifikacije PCR-a. Zbog linearnog odnosa između Ct vrijednosti šablona i početnog broja kopije predloška tokom eksponencijalnog perioda PCR amplifikacije, on postaje osnova za kvantifikaciju.
Osnovni princip PCR tehnologije sličan je procesu prirodne replikacije DNK, a njegova specifičnost ovisi o oligonukleotidnim početnicima komplementarnim s oba kraja ciljne sekvence.
PCR reagensi
PCR komplet uključuje pročišćeni šablon nukleinske kiseline, deoksiribonukleotid (dNTP), oligonukleotidne prajmere i DNA polimerazu. Pročišćavanje nukleinske kiseline i procjena kvaliteta važni su koraci u procesu PCR eksperimenta. Važno je koristiti odgovarajuće tehnike za izolaciju i pročišćavanje nukleinskih kiselina iz sirovina, jer će ovaj korak utjecati na reakciju amplifikacije.
DNK polimeraza katalizira dodavanje dNTP -a produženim lancima DNA dodavanjem baza koje su komplementarne nizu šablona. Identifikacija termostabilnih DNA polimeraza i naknadne modifikacije ovih enzima igraju ključnu ulogu u razvoju i širokom usvajanju PCR reakcije.
PCR reakcija
Pet elemenata PCR reakcije: Postoji pet vrsta supstanci koje učestvuju u PCR reakciji: prajmeri (PCR prajmeri su fragmenti DNK, a početnici za replikaciju DNK u ćeliji su lanac RNK), enzimi, dNTP, šabloni i puferi ( od kojih je potreban Mg2+).
PCR koraci
Standardni proces PCR -a podijeljen je u tri koraka:
Denaturacija DNK: (90 ℃ -96 ℃): Dvolančani DNK šablon pod dejstvom toplote, vodikova veza puca i formira jednolančanu DNK.
Žarenje: (60 ℃ -65 ℃): Temperatura sistema se smanjuje, a prajmeri se kombinuju sa šablonom DNK kako bi se formirao lokalni dvostruki lanac.
Produžetak: (70 ℃ -75 ℃): Pod djelovanjem enzima Taq (oko 72 ℃, najbolja aktivnost), dNTP se koristi kao sirovina, počevši od 3 ′ kraja prajmera i protežući se od 5 ′ → 3 ′ kraj. Sintetizirajte DNK lance komplementarne šabloni.
Svaki ciklus prolazi kroz denaturaciju, žarenje i produženje, a sadržaj DNK se udvostručuje. Sada neki PCR-i imaju kratko područje amplifikacije, pa čak i ako aktivnost enzima Taq nije optimalna, mogu se replicirati u kratkom vremenskom periodu, pa se može promijeniti u metodu u dva koraka, odnosno žarenje i produženje su izvodi na 60 ℃ -65 ℃ u isto vrijeme. Kako bi se smanjio proces porasta i pada temperature, brzina reakcije se povećava.
PCR rezultati i PCR analiza
1. Ako postoji standardna krivulja bai, izračunajte prema standardnoj krivulji. du
2. Općenito, relativna količina se izračunava metodom delta delta CT.
3. Primjeri su sljedeći: CT vrijednost gena A u kontrolnoj dao grupi je 20, a CT vrijednost interne kontrole (poput βaktina) je 15. CT vrijednost gena A u eksperimentalnoj skupini bila je 18, a CT vrijednost interne reference bila je 14.
4. Prvo izračunajte volumen uzorka: delta CT = 15-14 = 1. Snaga 2 je 2. Drugim riječima, volumen uzorka eksperimentalne grupe dvostruko je veći od kontrolne grupe. Gen A: delta CT = 20-18 = 2. Snaga 2 je 4. Drugim riječima, količina gena A u eksperimentalnoj grupi bila je 4 puta veća od one u kontrolnoj grupi. Međutim, budući da je količina dodanog uzorka dvostruka, pa je 4 = 2 = 2, konačni relativni iznos je 2 puta.
5. Nekoliko tačaka: Mora se utvrditi specifičnost pojačanja. Može se oduzeti samo CT vrijednost iste mete (efikasnost pojačanja može biti različita). Snaga 2 je samo teoretska vrijednost, a stvarna efikasnost pojačanja je manja od 2. Syber Green.
PCR aplikacije
PCR se obično primjenjuje na sljedeće aspekte:
1. Osnovna istraživanja nukleinske kiseline: kloniranje genoma
2. Asimetrična PCR za pripremu jednolančane DNK za sekvenciranje DNK
3. Obrnite PCR za određivanje nepoznatih regija DNK
4. Obrnuta transkripcija daoPCR (RT-PCR) koristi se za otkrivanje nivoa ekspresije gena u stanicama, količine RNA virusa i izravno kloniranje cDNA specifičnih gena
5. Fluorescentna kvantitativna PCR se koristi za praćenje PCR proizvoda u stvarnom vremenu
6. Brzo pojačavanje krajeva cDNA
7. Detekcija ekspresije gena
8. Medicinske primjene: otkrivanje bakterijskih i virusnih bolesti; dijagnosticiranje genetskih bolesti; dijagnosticiranje tumora; prijavljivanje na forenziku.
PCR mašina
PCR mašina naziva se i PCR pojačalo gena, PCR pojačalo nukleinske kiseline, pojačalo nukleinske kiseline lančane reakcije polimeraze, to je vrsta instrumenta i opreme koja koristi PCR (polimerazna lančana reakcija, polimerazna lančana reakcija) tehnologiju za pojačavanje specifične DNK. u medicinskim i biološkim laboratorijima, na primjer, kako bi se utvrdilo hoće li uzorak pokazati kartu genetskih bolesti, dijagnozu zaraznih bolesti, replikaciju gena i testiranje očinstva.
PCR inc
Glavne kompanije profilisane na globalnom tržištu dijagnostike PCR -a su: Abbott Laboratories,
Agilent Technologies Inc.,
Alere Inc., Asuragen Inc.,
Biocartis Group Nv, Biofire Diagnostics LLC. (Nabavio Biomerieux),
Biomerieux Sa,
Bio-Rad Laboratories Inc.,
Cepheid (kompanija Danaher),
Genmark Diagnostics Inc.,
Hologic Inc., Luminex Corporation,
Meridian Bioscience Inc.,
Qiagen NV,
Quantumdx grupa,
rock,
Spartanska bioznanost,
T2 Biosistemi
