Kako razviti brzi test na osnovu imuno-hromatografije?

Brza navigacija
Šta je imunohromatografija?
Princip imunohromatografije
Uobičajena metoda ispitivanja u imunohromatografiji
Uobičajeno obojene čestice koje se koriste u imunohromatografiji
Šta je koloidno zlato?
Metoda ispitivanja tri vrste zasnovana na imunohromatografiji na koloidnom zlatu
Sirovine koje se koriste u razvoju imunohromatografije
Oprema koja se koristi u razvoju imunohromatografije
Postupak proizvodnje u razvoju imunohromatografije
Kako koristiti imunohromatografiju koloidnog zlata za otkrivanje sigurnosti hrane?
zaključak

Šta je imunohromatografija?

Imunohromatografija (imunohromatografski test, ICA) je nova vrsta imunološkog testa koja se pojavila početkom 1980-ih. To je jednostavan i brz imunološki test uspostavljen na osnovu imunofiltracije (IFA).

Princip imunohromatografije

Princip imunohromatografije je fiksiranje specifičnog antitijela na određenoj zoni nitrocelulozna membrana. Kada se suvi kraj nitroceluloze uroni u uzorak (analit), zbog kapilarnog djelovanja, uzorak će se kretati naprijed duž membrane, kada se kreće u područje gdje je antitijelo fiksirano, odgovarajući antigen u uzorku se specifično vezuje za antitijelo. . Ako je obojeno imunogoldom ili imunoenzimom, područje može pokazati traku boje kako bi se postigla specifična imunodijagnoza.

Uobičajena metoda ispitivanja u imunohromatografiji

Radioimunski test (RIA)

RIA tehnologija koristi antigene ili antitijela označena radioaktivnim izotopima (poput 125I, zhi32P, 3H itd.) Za mjerenje radioaktivnosti γ-zraka ili β-zraka pomoću detektora γdao-zraka ili brojača tekuće scintilacije za određivanje antitijela ili volumena antigena tehnologija. Uključuje radioimunski test koji karakteriše označeni antigen i imunoradiometrijski test (IRMA) koji karakteriše označeno antitelo. Prvi uglavnom koristi metod konkurentnog vezivanja u tekućoj fazi, koji mjeri i makromolekularne antigene i antigene malih molekula; potonji koristi čvrstu fazu za mjerenje makromolekularnih antigena.

RIA zauzima veliki udio u rano uspostavljenim metodama imunološkog ispitivanja pesticida i utvrdio je zračenje dieldrina, aldrina, 2,4-D i 2,4,5-T, parationa i parakvata. Imunološki test. Iako je ova metoda vrlo osjetljiva (RIA je obično 10-9 g, 10-12 g ili čak 10-15 g) i ima širok raspon primjena, za izvođenje RIA potrebni su skupi brojači, a postoje i problemi poput zračenja i zagađenja . Primjena i razvoj polja otkrivanja podliježu određenim ograničenjima i postupno se zamjenjuju drugim imunološkim metodama.

Imunološki test enzima (enzimski imunološki test, EIA)

EIA je tehnologija imunološkog ispitivanja razvijena nakon RIA -e. Princip detekcije sličan je principu radioimunološkog testa, ali se koristi oznaka enzima koji organski kombinira specifičnu imunološku reakciju antigena i antitijela s visokoefikasnom katalizom enzima. Mjeri se aktivnost enzima vezanog za čvrstu fazu kako bi se odredila mjera tvari. Enzimi koji se koriste kao markeri uključuju peroksidazu hrena (HRP) i alkalnu fosfatazu (AKP), glukoznu oksidazu (GO), ureazu (ureazu) itd.

Čvrsta podloga za reakciju označavanja enzima uključuje polistirenske plastične cijevi i membrane. Trenutno se većina mikrotitarskih ploča sa 96 jažica (MTP) koristi kao čvrsta podloga. Ova vrsta ploča ima veliki kapacitet detekcije i veliki broj uzoraka, a samo jednostavan čitač mikroploča može dobiti točne podatke o otkrivanju. Neki znanstvenici također koriste magnetske perle kao materijale u čvrstoj fazi za EIA istraživanje. Princip je omotati polimerne materijale (polistiren, polivinil klorid itd.) S vanjske strane malih metalnih čestica (Fe2O3, Fe3O4), a zatim se kemijski povezati s amino skupinama. (-NH2), karboksil (-COOH), hidroksil (-OH) i druge aktivne grupe su povezane sa antitijelima ili antigenima za stvaranje imunih perli. Prednosti ove metode su u tome što mikro kuglice imaju veliku specifičnu površinu, jak adsorpcijski kapacitet i mogu se suspendirati u tekućoj fazi radi brzog i jednoličnog hvatanja analita u uzorak. Nakon nanošenja magnetskog polja, mikro kuglice se mogu brzo odvojiti od otopine uzorka, čime se smanjuje detekcija. Vrijeme, poboljšajte osjetljivost otkrivanja.

Budući da se reagensi označeni enzimima lako pripremaju, stabilni su i jeftini, a osjetljivost enzimskog imunološkog testa bliska je onoj radioimune tehnologije, EIA tehnologija se posljednjih godina brzo razvijala i razvijene su različite metode procjene utjecaja na okoliš. Među njima, enzimski imunološki test (enzimski imunosorbentni test, ELISA) trenutno je najrasprostranjenija tehnika enzimskog imunološkog ispitivanja u otkrivanju ostataka pesticida.

Imunološki test fluorescencijom (fluorescentni imunološki test, FIA)

Osnovni princip otkrivanja FIA-e je organsko kombiniranje visoke specifičnosti antigena i antitijela sa osjetljivom mjerljivošću fluorescencije, te korištenje fluorescentnih tvari kao traktora za označavanje antitijela, antigena ili molekula haptena za pripremu visokokvalitetnih specifičnih fluorescentnih reagensa. Kada fluorescentna tvar u konjugatu antigen-antitijelo zrači ultraljubičasto ili plavo svjetlo, može apsorbirati svjetlosnu energiju i ući u uzbuđeno stanje. Kada se iz pobuđenog stanja vrati u osnovno stanje, može emitirati apsorbiranu svjetlosnu energiju u obliku elektromagnetskog zračenja, što rezultira fluorescencijom. Iscrtavanje krivulje koncentracije pesticida-intenziteta fluorescencije može kvalitativno i kvantitativno otkriti ostatke pesticida u uzorcima.

Fluorescein pogodan za označavanje antitijela, antigena ili molekula haptena mora ispunjavati zahtjeve:

1. Trebala bi imati kemijsku skupinu koja može formirati stabilnu kovalentnu vezu s molekulom proteina ili se lako transformirati u ovu vrstu reakcije bez uništavanja njene fluorescentne strukture;
2. Nakon označavanja, kemijska struktura i svojstva fluoresceina i antitijela ili antigena neće se promijeniti;
3. Efikasnost fluorescencije je visoka, a zahtev za vezivanje sa proteinima mali;
4. Postupak vezivanja fluoresceina za protein je jednostavan i brz, a slobodni fluorescein i njegovi proizvodi razgradnje lako se uklanjaju;
5. Konjugat ima stabilne performanse pod opštim uslovima skladištenja i može se skladištiti dugo vremena.

Imunološki test hemiluminiscencije (luminiscentni imunološki test, LCIA)

LCIA se može podijeliti na hemiluminescentni imunotest (hemiluminescentni imunotest, CLCIA) i bioluminiscentni imuno test (bio-luminiscentni imuno test, BLCIA).

1976. godine Shroeder je prvi put uspostavio homogenu tehnologiju imunološkog testa hemiluminiscencije koristeći sistem biotin (B) -avidin (A). Nakon toga, Halman i Velan proširili su ga na heterogene sisteme, koji su sada infiltrirani u biološka istraživanja. Razna polja. Princip je naznačiti kombinaciju antigen i antitijela luminiscencijom. Kada se luminiscentna oznaka kombinira s odgovarajućim antitijelom ili antigenom, supstrat reagira s enzimom, ili redoks reakcijom sa luminiscentnim sredstvom ili fluorescentnom tvari (poput rubrena itd.) Uzbudi i oslobodi svjetlosnu energiju. Konačno, svjetlosni intenzitet je izmjeren fotometrom za kvantitativnu analizu. Uobičajeno korišteni luminiscentni markeri su peroksidaza hrena (HRP), luminol (luminol), izoluminol (izoluminol), lofin (lofin), lucigen (lucigen), dvostruki (2, 4, 6) -triklorobenzen) oksalat, bifeniltriol i 6 [N- (4-diaminobutil) -N-etil] -amino-2,3-dihidrofenazin-1,4-dion (ABEI) itd. Kada se antitijelo (ili antigen) označeno gore spomenutim luminiscentnim markerom kombinira sa odgovarajućim antigenom (ili antitijelo) u određenoj otopini pH pufera, emitirat će svjetlost pod djelovanjem kooperativnog faktora (poput H2O2, itd.), a njegov svjetlosni intenzitet bit će isti kao i ispitivane tvari. Proporcionalna je koncentraciji, pa se može koristiti za kvantitativnu analizu.

Imunološki test luminiscencije ima prednosti snažne specifičnosti, visoke osjetljivosti (granica detekcije od 10-15 mol/L), brze (1 ～ 3 h) i jednostavne dostupnosti luminiscentnih materijala. Međutim, na proces i intenzitet luminiscencije često utječu kemijska struktura same luminiscentne tvari, pH medija, ko-luminiscentna tvar i nečistoće metalnih iona.

Imunohromatografski test sa zlatom (zlatno-imuno-hromatografski test, GICA)

Princip otkrivanja GICA -e je premazivanje liganda (antitijela ili antigena) na mikroporoznu membranu poput nitroceluloznih membrana u linearnom obliku. Oznaka koloidnog zlata također je pričvršćena ligandima ili drugim tvarima u suhom stanju na upijajući materijal. Kapilarno djelovanje uzrokuje da otopina uzorka pliva po hromatografskoj traci. Kad dopliva do koloidnog zlatnog markera, ako uzorak sadrži receptor za ispitivanje, prvi korak je visoko specifičan imunološki odgovor za stvaranje imunološkog kompleksa. Kada tvar nastavi plivati ​​do područja linearnog premaza, drugi korak je visoko dolazi do specifičnog imunološkog odgovora, a formirani imunološki kompleks je zarobljen u obloženom linearnom području, a crvenu traku prikazuje označeno koloidno zlato (detekcijska traka), dok slobodna oznaka prelazi traku za detekciju i automatski se odvaja od vezane oznake . Kvalitativno ili kvantitativno određivanje može se postići otkrivanjem prisutnosti ili odsutnosti boje ili nijanse boje na pojasu2.

Detekcija kompleta za koloidno zlato

GICA metoda ima prednosti brzih (5-20 minuta), jeftinih, jasnih rezultata, bez složenih operativnih vještina i posebne opreme, te jednostavne za nošenje. Međutim, u usporedbi s drugim metodama imunološkog ispitivanja, osjetljivost otkrivanja ove metode je nešto niža i uglavnom je pogodna za brzo kvalitativno ili polukvantitativno određivanje na licu mjesta. Trenutno se ova metoda koristi u mnogim istraživačkim područjima, poput medicine i biologije, a široko se koristila, posebno u razvijenim zemljama.

Kombinovana tehnologija imunotesta i tehnologije instrumentalne analize

Korištenje jedne IA tehnike za analizu ostataka pesticida ima manje podataka, a selektivnost metoda fizičke i kemijske analize relativno je slaba. Kramer i dr. koristili su imunološke testove i tečnu hromatografiju (LC) u kombinaciji, čime se pojednostavljuje metoda analize i poboljšava efikasnost detekcije. Kombinacija LC-IA kombinira visoku sposobnost razdvajanja LC-a s visokom osjetljivošću i visokom specifičnošću IA. Ova metoda analize posebno je pogodna za višekomponentnu analizu ostataka i mikroanalizu. Kombinacija imunološkog testa i plinske hromatografije ili masene spektrometrije (GC ili MS) može smanjiti unakrsne reakcije u analizi pesticida ili metabolita sa sličnom strukturom radi smanjenja lažno pozitivnih rezultata.

Uobičajeno obojene čestice koje se koriste u imunohromatografiji

Nanočestica koloidnog zlata
Čestice lateksa
Ugljikove čestice
Magnetske perle
Fluorescentne boje
Kvantne tačkice
Upconversion luminescent

Šta je koloidno zlato?

Koloidno zlato, poznata i kao nanočestice zlata, stabilna je, jednolična i jedno dispergirana suspenzija čestica zlata suspendiranih u tekućini nakon što se zlatna sol reducira u zlato. Čestice zlata sastavljene su od atoma zlata i dvostrukog ionskog sloja koji ga okružuje.

Boja otopine ovisi o boji materijala disperzne faze, disperziji materijala disperzne faze i vrsti upadne svjetlosti, bilo da se radi o raspršenoj ili propuštenoj svjetlosti. Što su čestice manje i veća disperzija, kraća je valna duljina raspršene svjetlosti. Za hidrosol iste tvari veličina čestica je različita, a boja je također različita.

Na primjer, čestice koloidnog zlata veličine između 5-20 nm, valna duljina apsorpcije 520 nm, boje su crnog vina; veličina između 20-40 nm uglavnom apsorbira zeleno svjetlo s valnom duljinom od 530 nm, a otopina je tamnocrvena; čestica koloidnog zlata od 60 nm uglavnom upija narančastu svjetlost talasne dužine 600 nm, rastvor je plavo-ljubičasti. Čestice koloidnog zlata koje se općenito koriste u imunohistokemiji nalaze se u rasponu od 5-60 nm, a otopina izgleda crveno.

Metoda ispitivanja tri vrste zasnovana na imunohromatografiji na koloidnom zlatu

Najpopularnija obojena čestica je nanočestica zlata. Tehnologija koloidnog zlata koja kombinira imunološki odgovor antigen-antitijelo i tehnologiju označavanja koloidnog zlata za kvalitativno i kvantitativno otkrivanje sadržaja antigena i antitijela. Zbog svojih prednosti, poput brzine, jednostavnosti, niske cijene i dobre stabilnosti, detekcija koloidnog zlata naširoko se koristi u području kliničke detekcije.

Trenutno, uobičajeno korištene metode detekcije platformi za otkrivanje koloidnog zlata uključuju sendvič metodu s dvostrukim antitijelima, konkurentnu metodu i indirektnu metodu. Postoje velike razlike između metode ispitivanja i analita.

Metoda sendviča s dvostrukim antitijelima

Sendvič metoda s dvostrukim antitijelima je najčešće korištena metoda detekcije za platforme za detekciju koloidnog zlata, koja se uglavnom koristi za otkrivanje relativno velikih biomolekula i čestica antigena. Metoda sa dvostrukim antitijelom zahtijeva pripremu uparenog antitijela antigena za testiranje. Jedno antitijelo je označeno koloidnim zlatom i fiksirano na jastučić konjugata, a drugo antitijelo je fiksirano na liniji za detekciju (T linija) NC membrane. Osim toga, potrebno je pripremiti sekundarno antitijelo koje se specifično veže za antitijelo označeno zlatom (tj. Koloidno antitijelo označeno zlatom) i pričvrstiti ga na kontrolnu liniju (C linija) NC membrane.

Kada se uzorak doda u traku, on će se prema principu kapilarnog protoka premjestiti na podlogu za uzorke, konjugovanu podlogu, T liniju, C liniju i upijajuću podlogu (upijajuća podloga). Reakcije svake faze prikazane su u sljedećoj tablici:

Stoga, kada su dvije crvene linije prikazane na traci, to znači da je tvar koja se testira u uzorku pozitivna; ako na traci postoji samo C linija, to znači da je tvar koja se testira u uzorku negativna. Visoka koncentracija tvari će imati jaču traku boja T-linije.

Metod takmičenja

Antigene malih molekula teško je pripremiti uparena antitijela (molekulska težina je premala, teško je pronaći dva mjesta vezivanja za dva antitijela koja se mogu vezati istovremeno), pa se antigeni malih molekula ne mogu otkriti sendvič metodom s dvostrukim antitijelima. Za antigene malih molekula, obično koristite metodu natjecanja za ispitivanje.

U konkurencijskoj metodi, antitijelo označeno zlatom fiksirano je na kojugatni jastučić o, a T linija na NC membrani fiksirana je s makromolekularno spojenim antigenom koji se testira (antigeni malih molekula ne mogu se direktno fiksirati na NC membranu. Stoga , potrebno je kemijski spojiti male molekule s BSA i drugim makromolekularnim tvarima, a zatim ih imobilizirati na NC membrani). Drugo antitijelo koje se može specifično vezati za antitijelo označeno zlatom imobilizirano je na C liniji.

Nakon što se uzorak doda u traku, on će se prema principu kapilarnog protoka premjestiti na podlogu za uzorke, konjugovanu podlogu, T liniju, C liniju i upijajuću podlogu (upijajuća podloga). Reakcije svake faze prikazane su u sljedećoj tablici:

Stoga, kada su dvije crvene linije prikazane na traci, to znači da je tvar koja se testira u uzorku negativna; ako na traci postoji samo C linija, to znači da je tvar koja se testira u uzorku pozitivna. Visoka koncentracija tvari će imati jaču traku boja T-linije.

Indirektna metoda

Indirektna metoda se uglavnom koristi za otkrivanje antitijela. Ako je indirektna metoda, konjugirani jastučić fiksiran proteinom A označenim koloidnim zlatom (protein A može se vezati za antitijela nespecifično). T linija na NC membrani fiksirana je antigenom koji se može specifično vezati za antitijelo koje se testira, a C linija na NC membrani fiksirana je antitijelom protiv proteina A.

Nakon što se uzorak doda u traku, on će se prema principu kapilarnog protoka premjestiti na podlogu za uzorke, konjugovanu podlogu, T liniju, C liniju i upijajuću podlogu (upijajuća podloga). Reakcije svake faze prikazane su u sljedećoj tablici:

Stoga, kada su dvije crvene linije prikazane na traci, to znači da je tvar koja se testira u uzorku pozitivna; ako na traci postoji samo C linija, to znači da je tvar koja se testira u uzorku negativna. Visoka koncentracija tvari će imati jaču traku boja T-linije.

Sirovine koje se koriste u razvoju imunohromatografije

1. Antigen i antitijela
2. Goveđi serum albumin
3. Bočni protok potporne kartice
4. Nitrocelulozna membrana
5. Uzorak jastučića (Wicking Pad)
6. Konjugirani jastučić
7. Upijajuća podloga
8. Membrana za odvajanje krvi (opcija)
9. Kućište kasete (opcija)

Oprema koja se koristi u razvoju imunohromatografije

1. Robotski sistem doziranja (Dispenzor)
2. Rezač traka za traku za ispitivanje bočnog protoka
3. Mikropipeta
4. Mašina za sušenje sa vakuumskim zamrzavanjem
5. Vakuum pećnica
6. Hladna centrifuga velike brzine
7. Sistem za rukovanje tečnošću (opcija)
8. Procesor kasete (opcija)

Postupak proizvodnje u razvoju imunohromatografije

1. Pripremljeno koloidno zlato
2. Označavanje koloidnog zlata
3. Izdavanje antigena ili antitijela na Nitrocelulozna membrana
4. Nitrocelulozna membrana se lijepi prateća kartica
5. Laminatni konjugirani jastučić na podložnoj kartici
6. Uložak uzorka laminata na podložnoj kartici
7. Upijajuća podloga od laminata na podložnoj kartici
8. Naljepnica s logotipom na upijajuću podlogu (opcija)
9. Rezanje nerezani list u trake
10. Stavite trake u vrećicu ili bocu od folije
11. Pakovanje u kutiji

Više detalja potražite u Kako razviti brzi test za ispitivanje lateralnog protoka?
Kako automatizirati montažu za brzo testiranje?

Kako koristiti imunohromatografiju koloidnog zlata za sigurnost hrane otkrivanje?

Imunohromatografija koloidnog zlata naširoko koristi u testiranju hrane dugi niz godina. Na primjer, kako se test mleka rad na ostacima antibiotika u sirovom mlijeku?

Antibiotski lijek je male molekule, pa se analizom odabire konkurentska metoda. Koji je mehanizam reakcije?

Pogledajmo strukturu trake:

Koloidno zlato označeno antitijelo liofilizirano u bunarske ploče. Odvojite od trake, produžite vrijeme inkubacije i povećajte osjetljivost otkrivanja.

Mehanizam reakcije bočnog toka

U pozitivnom uzorku:

1. Uzmite uzorak sirovog mlijeka i dodajte u mikro jažice
2. Ako sirovo mlijeko sadrži male molekule, poput beta laktama, tetraciklina, kloramfenikola, sulfonamida, cefalosporina, melamina itd.
3. Antitijelo označeno zlatom (Au-Ab) u mikro jažicama će uhvatiti male molekule iz uzoraka mlijeka i postati novi kompleks (Au-Ab vezan sa malim molekulama).
4. Dok se kompleks premješta u položaj T linije, ne postoji položaj za BSA-antigen (antigen koji se fiksirao na T lin) za konjugaciju, jer su nanočestice zlata već konjugirane s malim molekulama, pa se traka boje neće promijeniti.
5. Sekundarno antitijelo koje se fiksira na C liniji hvatat će antitijela označena zlatom i vidljivu traku u boji.
6. Rezultat će biti pozitivan.

U negativnom uzorku:

1. Antitijelo označeno zlatom (Au-Ab) ne može uhvatiti male molekule iz sirovog mlijeka, ali će ga uhvatiti antigen T linije, a zatim će se vidjeti traka u boji.
2. Sekondarno antitijelo C linije još uvijek hvata antitijela označena zlatom (Au-Ab), vidljiva traka u boji.

Tumačenje

Kolorimetrijska metoda za tumačenje testa mlijeka. Testna linija se uspoređuje s kontrolnom linijom kako bi se utvrdio pozitivan ili negativan rezultat. Tijekom proizvodnje kontrolirati količinu Au-Ab kako bi se postigao kolorimetrijski test.

zaključak

Imunohromatografija je vrlo popularna tehnologija ispitivanja, koja se široko koristi u in vitro dijagnostičkim proizvodima, ne samo za testiranje hrane. Posebno u testu lateralnog toka, imunohromatografija koloidnog zlata ne zahtijeva skupu opremu, laku za upotrebu, jeftinije troškove kako bi se bolje živjelo, na primjer, test trudnoće kod kuće.

Referenca:

• wikipedia: Test bočnog protoka

Kako započeti proizvodnju kompleta za testiranje Covid 19